高中生物 5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段教案 新人教版选修1.doc

1、专题专题 5 DNA5 DNA 与蛋白质技术与蛋白质技术 课题课题 5.2 5.2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增 DNADNA 片段片段 一、【课题目标】课题目标】 （一）知识与技能（一）知识与技能 1、了解 PCR 技术的基本操作 2、理解 PCR 的原理 3、讨论 PCR 的应用 （二）过程与方法（二）过程与方法 在多聚酶链式反应扩增 DNA 片段的实验过程中，应避免外源 DNA 污染，严格控制温度等反应条件 （三）情感、态度与价值观（三）情感、态度与价值观 通过对 PCR 实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神 二、 【课题重点】课题重点】 PCR 的原

2、理和 PCR 的基本操作 三、 【课题难点】课题难点】 PCR 的原理 四、 【教学教学方法】方法】 启发式教学 五、 【教学工具】教学工具】 多媒体课件 六、 【教学过程】教学过程】 （一）引入新课（一）引入新课 在现代生物技术中，DNA 技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、 古生物鉴定等都离不开对 DNA 分子碱基序列的分析。而分析 DNA 碱基序列，就需要一定量的 DNA 片段。怎 样迅速获得足够量的 DNA 片段呢？今天我们来研究学习 DNA 分子的扩增技术PCR 技术。 （二）进行新课（二）进行新课 1 1基础知识基础知识 PCR 技术扩增 DNA 的过

3、程，与细胞内 DNA 复制过程类似： 11 细胞内 DNA 复制条件分析： 条件 组分 作用 模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成 DNA 子链的原料 酶 解旋酶 DNA 聚合酶 打开 DNA 双螺旋 催化合成 DNA 子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 RNA 为 DNA 聚合酶提供合成的 3端起点 12 细胞内 DNA 复制过程 （1）DNA 的反向平行结构： （结合教材图 56） 核苷酸分子的结构与方向性： （分子结构模式图） 由核苷酸通过 3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链： （模式图，体现方向性） 。 DNA 双螺旋结构的反向平行结构：

4、 （2）DNA 的复制过程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA 两条链打开， ，形成两条 DNA 单链。 引物结合：在 DNA 单链 3端与 DNA 反向配对结合，确保引物 3端与 DNA 单链准确配对。 DNA 聚合酶结合： 子链合成：DNA 聚合酶从引物 3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工：DNA 聚合酶 I 将引物切去，并合成空缺处的 DNA 单链，再由 DNA 连接酶将不连续的 DNA 子 链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链） 子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“53合成” 。 感悟生命的神秘：DNA 聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入

5、一个核 苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA 聚合酶没有校对功 能， 因此 RNA 的合成不需要引物， 而是从头合成的， 它的错配可能性较大， 在 RNA 引物完成功能后即被 DNA 聚合酶 I 删去，代之以高保真的 DNA 链。 思考DNA 分子能准确复制的原因有哪些？ DNA 双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA 聚合酶的复查功能。 思考细胞内哪些物质是从头合成的？RNA 合成、蛋白质合成。 13DNA 分子复制的人工控制 解开螺旋：在 80100时，DNA 双螺旋打开，形成两条 DNA 单链，称为变性。 恢复螺旋：在 50左右时，两条 DNA

6、 单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液,DNA 模板,四种脱氧核苷酸,热稳定 DNA 聚合酶,两种引物。 反应场所：PCR 仪（自动温度周期性调节） 。 思考缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4PCR 的反应过程 变性：在 95时 DNA 解旋 复性：在 50时引物与 DNA 单链结合 延伸：在 72时合成 DNA 子链（两个引物间的序列） 2 2实验操作实验操作 21 PCR 反应体系：缓冲液、DNA 模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定 DNA 聚合酶、两种 RNA 引物， 水 22 实验操作步骤 23 按照 PCR 反应体系配方配制反应液； （2）将 PCR 反应体系 5

7、0L 用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中； （3）将微量离心管放到 PCR 仪中； （4）设置 PCR 仪的工作参数。 （5）DNA 在 PCR 仪中大量扩增。 变性变性 复性复性 延伸延伸 24 水浴法：将微型离心管依次在 95、55、72的恒温水浴锅中循环处理相应时间。 3 3实验注意事项实验注意事项 31 避免外源 DNA 污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 32 缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。 33 每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。 34 混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。 4 4结果分析与评价结果分析与评价 41 反应液稀释：取 2LP

8、CR 反应液，添加 98L 蒸馏水；2分光光度计调零：将 100L 蒸馏水添加 到比色杯中，在 260nm 处将分光光度计调整读数为零。 42 将 100L 反应稀释液倒入比色杯中，测定在 260nm 处的光吸收值。 43 计算：DNA 含量50光吸收值稀释倍数 （三）课堂总结、点评（三）课堂总结、点评 （四）实例探究（四）实例探究 例 1 在（ ）的温度范围内，DNA 的双螺旋结构解开 A. 1020 B. 80100 C. 2030 D. 4060 解析：蛋白质大多不能忍受 6080的高温，而 DNA 在 80以上才会变性。 答案：B 例 2 关于 DNA 的复制，下列叙述正确的是（ ）

9、A. DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从 5端延伸 DNA 链 B. DNA 复制不需要引物 C. 引物与 DNA 母链通过碱基互补配对进行结合 D. DNA 的合成方向总是从子链的 3端向 5端延伸 解析：由于 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，只能从引物的 3端即复制方向由 3端向 5端延伸； 由于 DNA 分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在 DNA 聚合酶作用下合成的，其合成方向是 从子链 5端向 3端延伸。 答案：C 综合应用综合应用 例 3 下列有关 PCR 描述，不正确的是（ ） A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性 C. 扩增产量按

10、y（1X）n D. 扩增对象是氨基酸序列 E. 扩增对象是 DNA 序列 多 聚 酶 链 式 反 应 扩 增 DNA 片 段 PCR 原理 DNA 的复制需要酶、原料、能量、引物 DNA 的变性和复性受温度影响 PCR 过程 变性 复性 延伸 操作步骤 配制 PCR 反应体系 移入离心管 放入 PCR 设置工作参数 DNA 扩增 测定含量 稀释 调零 测定并读数 计算 解析：PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术，它以极少量的 DNA 为模板，以四种脱氧核苷酸为原 理，在引物的作用下使 DNA 聚合酶从引物的 3端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的 DNA 拷 贝，其扩增产量为

11、 y（1X）n，y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，x 表示平均每次的扩增效率，n 代表 循环次数，因此答案选 D。 答案：D （五）巩固练习（五）巩固练习 1DNA 分子复制时，解旋的两条链中（ ） A 仅一条作为复制模板 B 两条链作为模板并复制出两个不同的 DNA 分子 C 两条链作为模板并复制出两个相同的 DNA 分子 D 两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合 成一个全新的 DNA 分子 2.下列关于 DNA 复制过程的正确顺序是（ ） 互补碱基对之间氢键断裂互补碱基对之间形成氢键DNA 分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后 的母链为模板

12、进行碱基互补配对子链与母链盘旋成双螺旋状结构 A B C D 3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（ ） DNA 复制RNA 复制转录翻译逆转录 A B C D 4.实验室内模拟生物体 DNA 的复制必需的一组条件是（ ） 酶游离的脱氧核苷酸ATPDNA 分子mRNAtRNA适宜的温度适宜的酸碱度 A B C D 5.利用 PCR 技术，把一个双链 DNA 分子当作第一代，经过 3 次循环，在第四代 DNA 分子中，有几条第 一代脱氧核苷酸的长链？（ ） A 2 B 4 C 8 D 16， 6.关于 DNA 分子的叙述中，正确的是（ ） A .DNA 的两条链是极性相同，同向平行

13、B.DNA 的两条链是极性相同，反向平行 C.DNA 的两条链中极性不同，反向平行的 D.DNA 的两条链是极性不同，同向平行 7.假设 PCR 反应中，只有一个 DNA 的片段作为模板，请计算在 30 次循环后，反应物中大约有多少这 样的 DNA 片段（ ） A 215 B 230 C 260 D 231 8.DNA 的合成方向总是（ ）延伸。 A 从 DNA 分子的左端向右端 B 从 DNA 分子的右端向左端 C 从子链的 5，端向 3，端 D 从子链的 3，端向 5，端 9.要使 PCR 反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（ ） A 氧气的浓度 B 酸碱度 C 温度 D 大气的

14、湿度 10.DNA 分子经 PCR 反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（ ） A 模板母链相同 B 非模板母链相同 C 两条模板母链相同 D 两条模板母链都不相同 答案： CDADA CBCCB 七、 【课余作业】课余作业】 1、PCR 与生物体 DNA 复制有何区别？ 2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？ 八、 【教学体会】教学体会】 教师在教学过程中，可以鲜引导学生回忆必修 2 的有关 DNA 复制的知识，在此基础上，学生可加深对 于 PCR 原理的认识。对于 PCR 反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的

15、描绘了参 与 PCR 的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学 中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师 要及时给予解答。 九、 【资料袋】资料袋】 免疫免疫- -PCRPCR 免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性 和 PCR 扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测. 免疫-PCR 试验的主要步骤有三个:抗原-抗体反应，与嵌合连接分子结合，PCR 扩增嵌合连接分 子中的 DNA(一般为质粒 DNA).该技术的关

16、键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR 中，嵌合连接分子起 着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒 DNA 结合，其基本原 理与 ELISA 和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒 DNA，在操作反应中形成抗原 抗体-连接分子-DNA 复合物，通过 PCR 扩增 DNA 来判断是否存在特异性抗原. 免疫 PCR 优点为:特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.敏感度高，PCR 具有 惊人的扩增能力，免疫 PCR 比 ELISA 敏感度高 105 倍以上，可用于单个抗原的检测.操作简便，PCR 扩增 质粒 DNA 比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.