第二章基因工程载体和工具酶课件.ppt
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1、2023-7-31第二章基因工程载体和工具酶第二章基因工程载体和第二章基因工程载体和工具酶工具酶第二章基因工程载体和工具酶本章目录本章目录l2.1 2.1 载体载体l2.1.1 2.1.1 质粒载体质粒载体l2.1.2 2.1.2 噬菌体载体噬菌体载体l2.1.3 2.1.3 其他载体其他载体l2.2 2.2 工具酶工具酶l2.2.1 2.2.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶l2.2.2 DNA2.2.2 DNA聚合酶和聚合酶和KlenowKlenow大片段大片段l2.2.3 DNA2.2.3 DNA连接酶连接酶l2.2.4 2.2.4 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 l2.2.5 2.2.5 末端
2、脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶第二章基因工程载体和工具酶第二章第二章 基因工程载体和工具酶基因工程载体和工具酶第一节第一节 载体载体第二章基因工程载体和工具酶载体的功能及特征载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第二章基因工程载体和工具酶克隆载体应具备的条件克隆载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源
3、高的外源DNA的装载能力的装载能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点 第二章基因工程载体和工具酶1.1.质粒质粒 plasmidplasmidl细菌染色体外的遗传因子,闭合环状双链细菌染色体外的遗传因子,闭合环状双链DNADNAl大小:大小:1-200kb1-200kbl能自主复制,但要利用寄主细胞复制染色体的同能自主复制,但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系一组酶系l复制分松弛型和严谨型两种复制分松弛型和严谨型两种 松弛型:松弛型:10-200 10-200 拷贝(
4、加氯霉素扩增)拷贝(加氯霉素扩增)严谨型:严谨型:1-10 1-10 拷贝拷贝l有某些基因,如抗药性基因,对寄主的生长是有有某些基因,如抗药性基因,对寄主的生长是有利的利的第二章基因工程载体和工具酶天然质粒天然质粒第二章基因工程载体和工具酶第二章基因工程载体和工具酶PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒的自主复制性:ColE1、pMB1、pSC101等不同启动子等不同启动子pMB1质粒DNA复制启动控制松弛型质粒启动子的突变质粒的基本特征质粒的基本特征第二章基因工程载体和工具酶2.质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在任何两种含有相似复制
5、子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为于一个细胞中,这种现象称为质粒的不相容性。质粒的不相容性。质粒的基本特质粒的基本特征征以大肠杆菌的质粒为例:以大肠杆菌的质粒为例:lColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构,彼此不相容拥有相似的复制子结构,彼此不相容lpSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的拥有相似的复制子结构复制子结构,彼此不相容,彼此不相容第二章基因工程载体和工具酶3.携带特殊的遗传标记:抗生素标记基因携带特殊的遗传标记:抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 2)2)四环素抗性基因四环素抗性基因 3)3)氯霉
6、素抗性基因氯霉素抗性基因 4)4)卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素抗性基因 5 5)lacZlacZ基因基因质粒的基本特征质粒的基本特征3.携带特殊的遗传标记:抗生素标记基因携带特殊的遗传标记:抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 2)2)四环素抗性基因四环素抗性基因 3)3)氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 4)4)卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素抗性基因 5 5)lacZlacZ基因基因第二章基因工程载体和工具酶Lac Z基因的显色原理:基因的显色原理:第二章基因工程载体和工具酶第二章基因工程载体和工具酶第二章基因工程载体和工具酶第二章基因工程载体和工具酶La
7、cZLacZ基因表基因表达的蓝白斑达的蓝白斑菌落菌落第二章基因工程载体和工具酶基因工程质粒:基因工程质粒:Plasmid pBR322Plasmid pBR322松驰型质粒松驰型质粒AmpAmpr r,TetTetr r多种限制性酶切位点多种限制性酶切位点全长全长 4362 bp4362 bp第二章基因工程载体和工具酶Plasmid pBR322Plasmid pBR322结构图结构图4363bp第二章基因工程载体和工具酶pBR322pBR322质粒结构来源质粒结构来源第二章基因工程载体和工具酶Plasmid plink 322l在pBR322基础上改建,增加了一个多接头(polylinker
8、),即增加了多克隆位点。l全长 3.8 kb第二章基因工程载体和工具酶Plasmid plink 322第二章基因工程载体和工具酶 pUC pUC 质粒质粒(University of California)(University of California)lpUC pUC 质粒质粒 是由大肠杆菌是由大肠杆菌 pBR322 pBR322 质粒质粒 与与M13 M13 噬菌体改建噬菌体改建而成的双链而成的双链DNADNA质粒载体质粒载体l pUC 18/pUC 19 pUC 18/pUC 19 全长全长 2674 bp 2674 bp,有,有 Amp Amp 抗性基因,一个抗性基因,一个复制起
9、点复制起点oriori。带有。带有lac Zlac Z的的N N端端 标记序列;因在复制起点标记序列;因在复制起点oriori区域内缺失区域内缺失 rop rop 基因(改进的基因(改进的pMB1pMB1复制子),细胞即使复制子),细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数(生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数(500-700500-700)。)。l宿主菌携带宿主菌携带半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端序列。重组子菌落是白色,端序列。重组子菌落是白色,空转化子是蓝色。空转化子是蓝色。第二章基因工程载体和工具酶Plasmid pUC 18/pUC 19 结构结构 第二章基因工程载体和工具酶改建质粒的
10、要求:改建质粒的要求:l尽可能使质粒缩小,以便插入更大的外源DNA片段;l增加多种酶切位点;l增加标记基因;l提高外源DNA的表达水平;l增加质粒在受体细胞中的拷贝数第二章基因工程载体和工具酶转化子的筛选方法转化子的筛选方法l遗传标记筛选(载体与目的基因本身)遗传标记筛选(载体与目的基因本身)lDNADNA片段大小检测片段大小检测l核酸分子杂交核酸分子杂交l目的基因表达产物检测目的基因表达产物检测第二章基因工程载体和工具酶pBR322 pBR322 质粒克隆外源基因的过程质粒克隆外源基因的过程 第二章基因工程载体和工具酶载体遗传标记检测载体遗传标记检测l抗药性筛选法抗药性筛选法ROPROISa
11、l IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bporil将外源将外源DNA片段插在片段插在EcoRI位点:位点:l非重组子呈非重组子呈 Apr、Tcr l重组子呈重组子呈 Apr、Tcr l将外源将外源DNA片段插在片段插在BamHI位点:位点:l非重组子呈非重组子呈 Apr、Tcr l重组子呈重组子呈 Apr、Tcs 第二章基因工程载体和工具酶l载体遗传标记检测载体遗传标记检测l显色筛选法显色筛选法pUC18AprlacZorilApr+X-gall重组子(重组子(Apr+lacZ-)l将外源
12、基因克隆在将外源基因克隆在pUC18的的lacZ标标记记基因内部,使之灭活,此时重组基因内部,使之灭活,此时重组子呈子呈Apr、lacZ-,白色菌落;而非,白色菌落;而非重组子则呈重组子则呈Apr、lacZ+,蓝色菌落,蓝色菌落 第二章基因工程载体和工具酶lDNADNA片段大小检测片段大小检测l全酶解图谱法:全酶解图谱法:pUC18 2.7 kblHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZorilBlBlElPl4.0 kbl1.0 kbl0.8 kbl用用BamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNAl电泳观察酶解产物片段:电泳观察酶
13、解产物片段:l重组子:重组子:2.7 kb+4.0 kbl非重组子:非重组子:2.7 kb第二章基因工程载体和工具酶lDNADNA片段大小检测片段大小检测l全酶解图谱法:全酶解图谱法:pUC18 2.7 kblHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBP4.0 kb1.0 kb0.8 kbl用用EcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNAl目的重组子:目的重组子:3.0 kb+3.7 kbl 或者:或者:1.0 kb+5.7 kbl用用PstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNAl目的重组子:目的重组子:3.2 kb+3.5 k
14、bl 或者:或者:0.8 kb+5.9 kb第二章基因工程载体和工具酶质粒质粒DNADNA提取的策略提取的策略l质粒质粒DNADNA的提取的提取细菌细胞破碎细菌细胞破碎-碱使染色体碱使染色体DNADNA变性变性-离心分离离心分离-收集质粒收集质粒DNA-DNA-纯化纯化-保存保存l真核细胞真核细胞DNADNA的提取的提取研磨使细胞破碎研磨使细胞破碎-蛋白酶蛋白酶K K去核蛋白去核蛋白-分离蛋白质与分离蛋白质与DNA-DNA-纯化纯化-沉淀沉淀-纯度检测纯度检测第二章基因工程载体和工具酶质粒质粒DNADNA的纯化的纯化lRNA酶去RNAlSDS-蛋白复合物l蛋白酶K去蛋白质l酚-氯仿抽提l纯化试
15、剂盒l紫外分光光度计测A260与A280值:18 或20第二章基因工程载体和工具酶质粒质粒DNADNA沉淀沉淀l二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。l乙醇沉淀时,加NaAc or NaCl至终浓度为01-025M,是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷,减少DNA分子同性电荷的相斥力。l06倍体积的异丙醇沉淀,-20C半小时。第二章基因工程载体和工具酶DNADNA分离分离l琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳l聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心第二章基因工程载体和工具酶DNADNA浓度检测浓度检测l琼脂糖凝胶电泳
16、琼脂糖凝胶电泳 0.05-0.10.05-0.1g glEB-EB-标准标准DNADNA浓度比较浓度比较:1 ng:1 ngl紫外分光光度计测紫外分光光度计测A260:0.1-1 ideal,0.05-1.5 acceptedA260:0.1-1 ideal,0.05-1.5 acceptedl纯度纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度,还可以通过分光光度计不但能确定核酸的浓度,还可以通过A260/A280A260/A280估计核酸纯度。纯估计核酸纯度。纯DNADNA其比值为其比值为1.81.8,纯,纯RNARNA为为2.02.0。如比值高于如比值高于1.81.8,说明,说明DNADNA样品中含
17、样品中含RNARNA,而样品中的酚和蛋,而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。白质将会导致比值降低。第二章基因工程载体和工具酶EB与与DNA第二章基因工程载体和工具酶DNADNA大小测量大小测量l凝胶上与标准分子量比较lHindIIIl100bp ladderl自己的marker第二章基因工程载体和工具酶在紫外透射仪下看在紫外透射仪下看DNADNA时,时,DNADNA亮度与哪些因素有亮度与哪些因素有关?关?lDNADNA浓度浓度lDNADNA大小大小l波长波长l纯度纯度lEBEB量等有关量等有关第二章基因工程载体和工具酶DNADNA电泳结果分析电泳结果分析第二章基因工程载体和工具酶2.2.噬菌
18、体噬菌体l 噬菌体噬菌体DNA DNA 是线性双链是线性双链DNADNA分子,分子,48.5kb48.5kbl噬菌体噬菌体粒子,粒子,DNADNA线性双链,带有线性双链,带有12bp12bp的粘性末端,称为的粘性末端,称为coscos位点。位点。噬菌体感染细菌以后,双链噬菌体感染细菌以后,双链DNADNA分子通过分子通过COSCOS位点成环状位点成环状l基因组三个区域:基因组三个区域:左侧:包括外壳蛋白基因,左侧:包括外壳蛋白基因,20kb20kb 中间区:中间区:18kb18kb 右侧:复制及裂解基因,右侧:复制及裂解基因,12kb 12kb DNA+DNA+外源外源DNADNA之和必须在之
19、和必须在39-53kb39-53kb之间,所以可插入之间,所以可插入7-21kb7-21kb的外源的外源片段片段 第二章基因工程载体和工具酶5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l-DNA噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构第二章基因工程载体和工具酶-DNA-DNA载体的构建:载体的构建:删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点野生
20、型的野生型的l l-DNA链上有链上有5个个EcoRI位点和位点和7个个HindIII位点,位点,不利于重组操作,必须删除至不利于重组操作,必须删除至1-2个个同时,为了便于各种来源的同时,为了便于各种来源的DNA片段的克隆,还需要增片段的克隆,还需要增 加一些单一的酶切位点加一些单一的酶切位点除了简单的切割外,还需要采用定点突变技术去除或增除了简单的切割外,还需要采用定点突变技术去除或增加酶位点加酶位点第二章基因工程载体和工具酶-DNA-DNA载体的构建:载体的构建:加装选择标记加装选择标记 与质粒不同,野生型与质粒不同,野生型-DNA-DNA上缺少合适的选择标记,上缺少合适的选择标记,因此
21、加装选择标记是因此加装选择标记是l-DNAl-DNA克隆载体构建的重要内克隆载体构建的重要内容容ll l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类:克隆载体上的选择标记主要有下列两类:l免疫功能类标记免疫功能类标记l颜色反应类标记颜色反应类标记第二章基因工程载体和工具酶-DNA-DNA载体的构建:载体的构建:加装选择标记加装选择标记 lacZllacZ基因编码基因编码b b-半乳糖苷酶,能催化半乳糖苷酶,能催化l无色的无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基l因插入到因插入到lacZ基因中,基因灭活,不能基因中,基因灭活,不能l合成蓝色化合物;而空载体合成蓝色化合物;而
22、空载体l l-DNA则产则产l生蓝色透明斑生蓝色透明斑第二章基因工程载体和工具酶(一一)插入型载体插入型载体第二章基因工程载体和工具酶第二章基因工程载体和工具酶在在Charon4Charon4载体中克隆载体中克隆外源外源DNADNA第二章基因工程载体和工具酶3.M133.M13单链噬菌体单链噬菌体lM13噬菌体的生物学特性:噬菌体的生物学特性:生物结构生物结构lM13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状lM13 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正链链DNA组成组成 lM13 DNA全长全长6407个核苷酸个核苷酸lM13 DNA上上至少有至少有10个基因个基因2700个外壳蛋白分
23、子个外壳蛋白分子lM13 噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞,但抑制其生长不裂解宿主细胞,但抑制其生长 第二章基因工程载体和工具酶第二章基因工程载体和工具酶大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体DNADNAlM13 DNA载体的构建:载体的构建:lIII VI I IV II X V VII IX VIII野生型野生型M13RF-DNAlIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体系列载体lacZpolylinker第二章基因工程载体和工具酶DNADNA测序测序片段的片段的扩增扩增第二章基因工程载体和工具酶4.4.柯斯质粒柯斯质粒cosmidcosmid
24、l19781978年由年由CollinsCollins和和 HohnHohn改建改建l正常的质粒与噬菌体的正常的质粒与噬菌体的coscos位点构成位点构成l有有AmpAmp,Tet Tet 抗性基因抗性基因 lCosCos位点可识别噬菌体的外壳蛋白,可被包装位点可识别噬菌体的外壳蛋白,可被包装 第二章基因工程载体和工具酶柯柯斯质粒(斯质粒(cosmid)的结构)的结构pHC796400 bpTcrl l fragmentcosoriAprPstIBamHISalI1.8 kb的的l l-DNA片段片段+pBR322片段片段装载范围为装载范围为31-45 kb第二章基因工程载体和工具酶柯斯质粒斯
25、质粒载体的特点:载体的特点:能像能像l l-DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞那样进行体外包装,并高效转染受体细胞 装载量大(装载量大(45 kb)且克隆片段具有一定的大小范围)且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便,筛选容易重组操作简便,筛选容易不能体内包装,不裂解不能体内包装,不裂解受体细胞受体细胞第二章基因工程载体和工具酶柯斯质粒的克隆过程第二章基因工程载体和工具酶5.5.人工微小染色体人工微小染色体 lYAC,yeast artificial chromosomelBAC,bacteria artificial
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