第二章微生物的纯培养和显微技术课件.pptx

1、2023年7月31日星期一第二章微生物的纯培养第二章微生物的纯培养和显微技术和显微技术第一节微生物的分别和纯培第一节微生物的分别和纯培育育 n无菌技术无菌技术n用固体培育基分别纯培育用固体培育基分别纯培育n用液体培育基分别纯培育用液体培育基分别纯培育 n单细胞单孢子分别单细胞单孢子分别 n选择培营养离选择培营养离 一、无菌技一、无菌技术术 n无菌技术：在分别、转接及无菌技术：在分别、转接及培育纯培育培育纯培育(物物)时防止其被时防止其被其他微生物污染的技术。其他微生物污染的技术。坚持无菌的方法坚持无菌的方法 n高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌n高温干热灭菌高温干热灭菌n棉塞棉塞n超净任务台等超净任务台

2、等 接种操作接种操作 二、用固体培育基分别纯培二、用固体培育基分别纯培育育 n菌落：单个微生物菌落：单个微生物在适宜的固体培育在适宜的固体培育基外表或外部生长、基外表或外部生长、繁衍到一定水平可繁衍到一定水平可以构成肉眼可见的、以构成肉眼可见的、有一定形状结构的有一定形状结构的子细胞生长群体。子细胞生长群体。n菌苔：当固体培育菌苔：当固体培育基外表众多菌落连基外表众多菌落连成一片时，便成为成一片时，便成为菌苔。菌苔。菌落菌落n菌落或菌苔是对微生物停止分类和鉴定的重要依据。菌落或菌苔是对微生物停止分类和鉴定的重要依据。细菌菌落特征剖面图细菌菌落特征剖面图细菌菌落特征正面图细菌菌落特征正面图菌落菌

3、落培育平板培育平板n培育平板平板：指熔化的培育平板平板：指熔化的固体培育基倒入无菌平皿，冷固体培育基倒入无菌平皿，冷却凝结后，盛有固体培育基的却凝结后，盛有固体培育基的平皿。平皿。平板分别微生物纯培育技平板分别微生物纯培育技术术 n稀释倒平板法稀释倒平板法 n涂布平板法涂布平板法 n平板划线分别法平板划线分别法 n稀释摇管法稀释摇管法 1、稀释倒平板法：、稀释倒平板法：n无菌水、梯度稀释、无菌水、梯度稀释、50左右的琼脂培育基、灭过左右的琼脂培育基、灭过菌的培育皿。留意要稀释妥当。菌的培育皿。留意要稀释妥当。n分别出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可失分别出单个菌落以后，重复上述操作数次，便

4、可失掉纯培育。掉纯培育。Pour plate稀释倒平板法稀释倒平板法涂布平板法涂布平板法Spread platen无菌水、梯度稀释无菌水、梯度稀释n涂布平板涂布平板 稀释倒平板法和涂布平板法稀释倒平板法和涂布平板法平板划线分别平板划线分别法法稀释摇管稀释摇管法法n用于分别严厉厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培育基的试管加热使琼脂熔化后冷却并坚持在50左右，将待分别的资料用这些试管停止梯度稀释，试管迅速摇动平均，冷凝后，在琼脂柱外表倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培育基与空气隔开。三、用液体培育基分别纯培育三、用液体培育基分别纯培育 n用于细胞大的细菌、原生植物和藻类等的纯化分别。n稀释

5、法：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大少数95%以上表现不生长，很能够失掉的是纯培育。四、单细胞单孢子分别四、单细胞单孢子分别 n单细胞分别：采取显微分别法从混杂群体中直单细胞分别：采取显微分别法从混杂群体中直接分别单个细胞或单个集体停止培育以取得纯接分别单个细胞或单个集体停止培育以取得纯培育。培育。n单细胞分别法的难度与细胞或集体的大小成正单细胞分别法的难度与细胞或集体的大小成正比。集体较大的可在低倍显微镜下停止，集体比。集体较大的可在低倍显微镜下停止，集体较小的那么需采用显微操作仪。较小的那么需采用显微操作仪。五、选择培营养离五、选择培营养离 n当某一种微生物所存在的数量与其他当某一种微

6、生物所存在的数量与其他微生物相比十分少时，单采用普通的微生物相比十分少时，单采用普通的平板稀释方法简直是不能够分别到该平板稀释方法简直是不能够分别到该种微生物的，故需采用选择培营养离种微生物的，故需采用选择培营养离法。法。1、应用选择培育基停止直接分、应用选择培育基停止直接分别别 n如要分别高温菌，可在高温条件停如要分别高温菌，可在高温条件停止培育；要分别某种抗生素抗性菌止培育；要分别某种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上停止株，可在加有抗生素的平板上停止分别。分别。2、富集培育、富集培育n主要是指应用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环主要是指应用不同微生物间生命活动特点的不同，

7、制定特定的环境条件，使仅顺应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落境条件，使仅顺应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大添加，人们可以更容易地从自然界中分别到所需的中的数量大大添加，人们可以更容易地从自然界中分别到所需的特定微生物。特定微生物。n富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分别能降解酚类化富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分别能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验为例。合物对羟基苯甲酸的微生物的实验为例。六、微生物的保藏技六、微生物的保藏技术术 n保藏时期微生物不死亡、不污染、不会因发保藏时期微生物不死亡、不污染、不会因发作而丧失重要的生物学性状。作而丧失

8、重要的生物学性状。n许多国度都设有相应的菌种保藏机构：许多国度都设有相应的菌种保藏机构：n中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会n美国典型菌种保藏中心美国典型菌种保藏中心n世界菌种保藏结合会等世界菌种保藏结合会等 菌种保藏菌种保藏n菌种保藏：就是依据菌种特性及保藏目菌种保藏：就是依据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。使其存活而得以延续。n关于消费中运用的菌种保藏培育基，关于消费中运用的菌种保藏培育基，要求比拟丰厚的氮源，以防止菌种退要求比拟丰厚的氮源，以防止菌种退步蜕变。步蜕变。菌种保藏方法菌种保藏方法n延续移

9、接延续移接n改动条件枯燥、高温、缺氧、缺乏营养等改动条件枯燥、高温、缺氧、缺乏营养等使菌株的代谢水平降低，乃至完全中止，到使菌株的代谢水平降低，乃至完全中止，到达半休眠或完全休眠的形状，而在一定时间达半休眠或完全休眠的形状，而在一定时间内失掉保藏，有的可保藏几十年或更长的时内失掉保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。间。n在需求时再经过提供适宜的生长条件使保藏在需求时再经过提供适宜的生长条件使保藏物恢复生机。物恢复生机。1、传代培育保藏、传代培育保藏n是微生物保管的基本方法。是微生物保管的基本方法。n琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培育琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培育等。等。n橡皮塞封口或用石蜡掩盖

10、，并放置高橡皮塞封口或用石蜡掩盖，并放置高温保管。温保管。n4保管。保管。2、冷冻保藏、冷冻保藏 n代谢作用中止。代谢作用中止。n细胞体积大者要比小者对高温更敏感，而无细胞壁者细胞体积大者要比小者对高温更敏感，而无细胞壁者那么比有细胞壁敏感。其缘由是高温会使细胞内水分那么比有细胞壁敏感。其缘由是高温会使细胞内水分构成冰晶，从而惹起细胞，尤其是细胞膜的损伤。构成冰晶，从而惹起细胞，尤其是细胞膜的损伤。n速冻及快速解冻可增加损伤；还可加一些维护剂，如速冻及快速解冻可增加损伤；还可加一些维护剂，如0.5%左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并经过降低左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并经过降低剧烈的脱水作

11、用而维护细胞；剧烈的脱水作用而维护细胞；n大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，普通应参大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，普通应参与各种维护剂以提高培育物的存活率。与各种维护剂以提高培育物的存活率。3、枯燥保藏法、枯燥保藏法 n沙土管保管和冷冻真空枯燥沙土管保管和冷冻真空枯燥保藏是最常用的二项微生物保藏是最常用的二项微生物枯燥保藏技术。枯燥保藏技术。沙土管保管沙土管保管 n普通将菌种接种至斜面，培育至长出少量普通将菌种接种至斜面，培育至长出少量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，参的孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，参与无菌沙土试管中，减压枯燥，直至将水与无菌沙土试管中，减压枯燥，直至将水分抽

12、干，最后用石蜡、橡胶塞等封锁管口，分抽干，最后用石蜡、橡胶塞等封锁管口，置冰箱保管。此法主要适用于产孢子的微置冰箱保管。此法主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间生物，如芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。相对较长。冷冻真空枯燥保藏冷冻真空枯燥保藏 n是将加有维护剂的细胞样品预先冷冻，使其解冻，然是将加有维护剂的细胞样品预先冷冻，使其解冻，然后在真空下经过水的升华作用除去水分。到达枯燥的后在真空下经过水的升华作用除去水分。到达枯燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置高温保管，样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置高温保管，从而使微生物处于枯燥、缺氧及高温的形状，生命活从而使

13、微生物处于枯燥、缺氧及高温的形状，生命活动处于休眠，可以到达临时保藏的目的。动处于休眠，可以到达临时保藏的目的。n用水升华的方式除去水分，手腕比拟平和，细胞受损用水升华的方式除去水分，手腕比拟平和，细胞受损伤的水平相对比拟小，存活率及保藏效果均不错，是伤的水平相对比拟小，存活率及保藏效果均不错，是目前运用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。目前运用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。第二节显微镜和显微技术第二节显微镜和显微技术 n显微镜的种类及原理显微镜的种类及原理 n显微观察样品的制备显微观察样品的制备 一、显微镜的种类及原一、显微镜的种类及原理理 n普通光学显微镜普通光学显微镜n暗视野显微

14、镜暗视野显微镜n相差显微镜相差显微镜n荧光显微镜荧光显微镜n透射电子显微镜透射电子显微镜n扫描电子显微镜扫描电子显微镜n扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜 普通复式光学显微镜n普通生物显微镜由三局部构成：普通生物显微镜由三局部构成：n照明系统：包括光源和聚光器。照明系统：包括光源和聚光器。n光学缩小系统：由物镜和目镜组成，是显光学缩小系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消弭球差和色差，目镜微镜的主体，为了消弭球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成。和物镜都由复杂的透镜组构成。n机械装置：保证光学系统的准确配制，用机械装置：保证光学系统的准确配制，用于固定资料和观察方便。于固定资料和观察方

15、便。分辨率分辨率n重要功用参数。重要功用参数。n显微镜物象能否清楚不只决议于缩小倍数，显微镜物象能否清楚不只决议于缩小倍数，还与显微镜的分辨率还与显微镜的分辨率resolution有关。有关。n分辨率是指显微镜或人的眼睛距目的分辨率是指显微镜或人的眼睛距目的25cm处能分辨物体最小距离的才干。处能分辨物体最小距离的才干。n分辨率的大小决议于光的波长和镜口角以分辨率的大小决议于光的波长和镜口角以及介质的折射率。及介质的折射率。分辨率n肉眼分辨率普通只要肉眼分辨率普通只要0.25mmn光学显微镜分辨率光学显微镜分辨率0.18mn电子显微镜可达电子显微镜可达0.2nmnR=0.5/sin/2n式中：

16、式中：n=介质折射率；介质折射率；=镜口角标本对镜口角标本对物镜镜口的张角，物镜镜口的张角，sin/2=镜口率镜口率介质介质空气空气水水香柏油香柏油溴萘溴萘折射率折射率11.331.5151.66二、显微观察样品的制备二、显微观察样品的制备 n要依据显微镜和样品的特点来制备。要依据显微镜和样品的特点来制备。主要讲述光学显微镜的制样。主要讲述光学显微镜的制样。1、活体观察、活体观察n压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立刻停压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立刻停止显微镜观察。止显微镜观察。n悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置

17、于特制的凹载玻片上后停止显微镜观察，为防止液滴蒸发变干，的凹载玻片上后停止显微镜观察，为防止液滴蒸发变干，普通还应在盖玻片周围加封凡士林。普通还应在盖玻片周围加封凡士林。n菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板外表，涂布放菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板外表，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培育，取下玻璃纸置于载玻片线菌或霉菌孢子悬液，经培育，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形状停止观察。上，用显微镜对菌丝的形状停止观察。n插片法：插片法：2、染色观察、染色观察n固定的目的：固定的目的：n杀死细菌并使菌体粘附于坡片上。杀死细菌并使菌体粘附于坡片上。n添加细菌对染料的亲和力。添加细菌对染料

18、的亲和力。n常用的方法有酒精灯火焰加热和常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种。化学固定二种。细菌染色法细菌染色法死菌死菌正染色正染色负染色：负染色：复杂染色法复杂染色法鉴别染色法鉴别染色法 革兰氏染色法革兰氏染色法 抗酸性染色法抗酸性染色法芽芽 孢孢 染染 色色 法法荚膜染色法等荚膜染色法等 活菌活菌:用美蓝或用美蓝或TTC氯化三苯基四氮唑等氯化三苯基四氮唑等 作活菌染色作活菌染色 姬姆萨染色法姬姆萨染色法染色观察染色观察第三节显微镜下的微生物第三节显微镜下的微生物 n微生物类群包括细胞型和非细胞型微生物类群包括细胞型和非细胞型两类，这里主要引见细胞型微生物。两类，这里主要引见细胞型微生物

19、。n细菌和古生菌细菌和古生菌 n真菌真菌 n藻类藻类 n原生植物原生植物 一、细菌和古生菌一、细菌和古生菌 n细菌的形状和陈列细菌的形状和陈列n古生菌古生菌n原核生物的细胞大小原核生物的细胞大小 1、细菌的形状和陈列、细菌的形状和陈列球菌球菌(Coccus)杆菌杆菌(Bacillus)螺旋菌螺旋菌(Spirlla)其他外形的细菌其他外形的细菌球菌(coccus)单球菌单球菌双球菌双球菌四联球菌四联球菌八叠球菌八叠球菌葡萄球菌葡萄球菌链球菌链球菌Arrangement of Spherical Bacterial Cellsdiplococci streptococci tetracocci s

20、arcinae staphylococci.单球菌显微镜下表示图单球菌单球菌(single coccus).双球菌显微镜下表示图双球菌双球菌(double coccus)Micrococcus aerobic,gram-positive,cell arranges mainly in pairs,or irregular clusters.They are often yellow,orange or red in colour 上：显微镜效果 下：电 镜 照 片 四联球菌四联球菌(Micrococcus lactis)八 叠 球 菌八叠球菌八叠球菌(Sarcina ureae)八叠球菌显微镜

21、下表示图 葡萄球菌左：电镜照片左：电镜照片右：显微镜下的金黄色葡萄球菌右：显微镜下的金黄色葡萄球菌葡萄球菌葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Staphylococcus-facultatively anaerobic,gram-positive,usually form irregular clusters,nonmotile,catalase positive but oxidase negative,ferment glucose anaerobically.staphylococcistaphylococci链球菌链球菌链球菌显微镜下表示图链球菌电镜照片链球菌电镜照片

22、Streptococcus -facultatively anaerobic or microaerophilic,catalase negative,gram-positive,Cell arranges in pairs or chains,usually nonmotile,A few species are anaerobic rather than facultative.电子显微镜下的结核菌电子显微镜下的结核菌 绿色的就是结核杆菌绿色的就是结核杆菌杆菌杆菌植物宿主细胞感染杆菌濒临死亡 电镜照片链杆菌链杆菌链杆菌链显微镜下的链杆菌显微镜下的链杆菌螺旋菌螺旋菌Spirlla)弧菌(vi

23、brio)螺菌（spirllum）螺旋体(spirochaeta)Vibrio,Spirillum and Spirochetevibriospirillumspirochete显微镜下的螺旋菌 幽门螺旋菌幽门螺旋菌左：显微数码摄像右：结构表示图放线菌的散布与生活方式放线菌的散布与生活方式放线菌普通散布在含量较低；无机物丰厚和呈放线菌普通散布在含量较低；无机物丰厚和呈微生物碱性的土壤中。微生物碱性的土壤中。107个个g左右左右能看到：南方春季深层黑土能看到：南方春季深层黑土 地的白丝地的白丝能闻到：泥土特有的泥腥味能闻到：泥土特有的泥腥味Chain of conidiosporesAgar s

24、urfaceSubstrate myceliumAerial hyphaeVarious types of spore-bearing structures on the streptomyces放线菌的形状结构形式图放线菌的形状结构形式图气生菌丝孢子丝分生孢子基内菌丝固体基质基内菌丝Substrate mycelium)又称营养菌丝，功用是吸收营养，直径 0.2-1.2um长度100600um，色素可有可无。基内基内菌丝菌丝放线菌放线菌气生菌丝Aerial mycelium)基内菌丝长到一定时期，长出培育基外，伸向空间的菌丝，直径11.4um,长短不一，外形不一，颜色较深。气生菌丝气生菌丝

25、孢子丝孢子丝(Reproductive mycelium)当气生菌丝生长发育到一定阶段，当气生菌丝生长发育到一定阶段，气生菌丝上分化出的可构成孢子的菌气生菌丝上分化出的可构成孢子的菌丝。丝。孢子的外形及在气生菌丝上陈列的孢子的外形及在气生菌丝上陈列的方式随种而异。方式随种而异。Various types of spore-bearing structures on the streptomyces放线菌孢子丝类型放线菌孢子丝类型直形弯曲丛生成束单轮生无螺旋 开环钩形原始螺旋形松螺旋 紧螺旋螺旋单轮生无螺旋两级轮生螺旋两级轮生放线菌的菌落形状菌落质地硬而且致密，菌落小而不普遍延伸菌落质地硬而且致

26、密，菌落小而不普遍延伸菌落外表呈严密的绒状或坚实、枯燥多皱。菌落外表呈严密的绒状或坚实、枯燥多皱。接种针难以挑取，有时可挑碎，有时可将整接种针难以挑取，有时可挑碎，有时可将整个菌落挑起。个菌落挑起。2、古生菌、古生菌细菌电子显微镜照片3、原核生物的细胞大小、原核生物的细胞大小普通光学显微镜下用测微尺测细菌大小细菌细胞的大小细菌细胞的大小细胞的大小是细菌分类特征细胞的大小是细菌分类特征不同细菌细胞大小不同不同细菌细胞大小不同同一细菌的不同菌龄细胞大小不同同一细菌的不同菌龄细胞大小不同细菌细胞大小还与营养等要素相关细菌细胞大小还与营养等要素相关细胞大小的测量结果只是近似值或平均值细胞大小的测量结果

27、只是近似值或平均值二、真菌二、真菌 n霉菌霉菌 n酵母菌酵母菌 Fungi1.Filamentous fungi2.Unicellular fungi1、霉菌、霉菌n霉菌即丝状真菌，有分枝与不分枝、无隔霉菌即丝状真菌，有分枝与不分枝、无隔菌丝根霉、毛霉与有隔菌丝青霉、菌丝根霉、毛霉与有隔菌丝青霉、曲霉之分。曲霉之分。n菌丝体：由许多菌丝交织在一同而组成。菌丝体：由许多菌丝交织在一同而组成。n在固体培育基上，真菌菌丝可分为：营养在固体培育基上，真菌菌丝可分为：营养菌丝、气生菌丝和繁衍菌丝。菌丝、气生菌丝和繁衍菌丝。霉菌霉菌n霉菌在发酵工业上普遍用来消费酒精、抗霉菌在发酵工业上普遍用来消费酒精、抗

28、生素青霉素、灰黄霉素、无机酸柠生素青霉素、灰黄霉素、无机酸柠檬酸、葡萄糖酸、维生素等。檬酸、葡萄糖酸、维生素等。n在农业上用于饲料发酵、植物生长激素在农业上用于饲料发酵、植物生长激素赤霉素、杀虫农药白僵菌剂等。赤霉素、杀虫农药白僵菌剂等。n另外，霉菌也是形成物品霉变的主要缘由。另外，霉菌也是形成物品霉变的主要缘由。Sporangiospore Sporangiospores are formed within a sporangium ConidiosporesConidiospores are arranged in chains at the end of a conidiophore C

29、onidiospores2、酵母菌、酵母菌 n酵母菌是一群以芽殖或裂殖来酵母菌是一群以芽殖或裂殖来停止无性繁衍的单细胞真菌，停止无性繁衍的单细胞真菌，以此与霉菌相区别。极少数种以此与霉菌相区别。极少数种可发生子囊孢子停止有性繁衍。可发生子囊孢子停止有性繁衍。n酵母菌在酿造、食品、医药工业等方面占有重要位酵母菌在酿造、食品、医药工业等方面占有重要位置。酵母菌细胞蛋白质含量高达细胞干重的置。酵母菌细胞蛋白质含量高达细胞干重的50%以以上，并含有人体必需的氨基酸，所以酵母菌可以成上，并含有人体必需的氨基酸，所以酵母菌可以成为食品和饲料的重要补充。为食品和饲料的重要补充。n腐生型酵母菌能使食品和其他原

30、料糜烂蜕变；白假腐生型酵母菌能使食品和其他原料糜烂蜕变；白假丝酵母白色念珠菌可惹起皮肤、粘膜、呼吸道丝酵母白色念珠菌可惹起皮肤、粘膜、呼吸道及泌尿系统等多种疾病，新型隐球酵母还能惹起慢及泌尿系统等多种疾病，新型隐球酵母还能惹起慢性脑膜炎、肺炎等疾病。性脑膜炎、肺炎等疾病。酵母菌酵母菌 三、藻类三、藻类 n藻类是指除苔藓植物和维管束植物以藻类是指除苔藓植物和维管束植物以外，基本上有叶绿素，可停止光协作外，基本上有叶绿素，可停止光协作用，并随同放出氧气的一大类真核生用，并随同放出氧气的一大类真核生物。集体大小差异很大。物。集体大小差异很大。n水华水华n赤潮赤潮 四、原生植物四、原生植物 n原生植物是一类缺少真正细胞壁，细胞通常无色，原生植物是一类缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动才干，并停止吞噬营养的单细胞真核生物。具有运动才干，并停止吞噬营养的单细胞真核生物。n原生植物在海水、海水中少量存在，它们也与各种原生植物在海水、海水中少量存在，它们也与各种动植物在不同组织水平上构成共同体，有些对宿主动植物在不同组织水平上构成共同体，有些对宿主有害，有些对宿主有利，有些对宿主有害。也有一有害，有些对宿主有利，有些对宿主有害。也有一些原生植物能惹起人类疾病。些原生植物能惹起人类疾病。裸藻裸藻