双缩脲法测定蛋白质.ppt

1、生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验记录实验记录实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。要求：要求：真实性真实性 原始性原始性 完整性完整性 条理性条理性实验报告的书写实验报告的书写实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包括：实验题目、实验目的括：实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤

2、与条件、实验结果、讨论和结、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结论等项目。论等项目。实验室规则实验室规则 上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法步骤。步骤。实验时应遵守实验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记实验时应遵守实验操作规程，按教师

3、要求，认真操作。要细心观察实验现象，认真记录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。录实验数据，作出结论，最后写出实验报告。要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品和器材。所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并

4、还原。实验完毕，仪器洗净放好。净放好。在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。偿和处理。严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保

5、安全。试剂使用规则试剂使用规则使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准液体。污染瓶中的标准液体。使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒

6、取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。用嘴吸取，以免造成意外。吸量管的使用吸量管的使用正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。端。调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻

7、度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁1515秒。秒。吸量管上端标有吸量管上端标有“吹吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为液。此类吸量管为“吹出式吹出式”，未标，未标“吹吹”字的吸量管，则不必

8、吹出管尖的残留字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。液体。(0.5ml(0.5ml以下的都要吹）以下的都要吹）吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管及试剂。及试剂。吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。冲洗干净，晾干备用。吸量管的使用注

9、意事项吸量管的使用注意事项玻璃器皿的一般清洗方法玻璃器皿的一般清洗方法一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗，一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2 23 3次。干燥备用。次。干燥备用。容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗2 23 3次，干燥次

10、，干燥备用。备用。比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸纸)擦拭。擦拭。上述所有玻璃器材洗净上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干后，根据需要晾干或烘干。或烘干。分光光度法分光光度法光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在人

11、的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400760nm，人的眼睛感觉不到的，人的眼睛感觉不到的还有红外光（波长大于还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长）、紫外光（波长200-400nm）、）、X射线等。射线等。在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。溶液的颜色与吸收光颜色的关系溶液的颜色与吸收光颜色的关系一般性实验一般性实验-1-1Beer-Lambert定律吸收光谱法基本定律定律吸收光谱法

12、基本定律描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。AKCL 或或 lgI0/I=KCLA A为溶液对光的吸光度为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度；，反映了物质对光的吸收程度；C C为溶液浓度为溶液浓度；L L为溶液厚度为溶液厚度；I I0 0为照射待测物质的单色光强度，为照射待测物质的单色光强度，I I为透过待测物质光线的光强度为透过待测物质光线的光强度，透光度，透光度T=I/IT

13、=I/I0 0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比；即溶液透过光的强度与入射光的强度之比；K K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。实验中溶液厚度不变，则实验中溶液厚度不变，则A AKCKC光吸收示意图光吸收示意图I I0 0I IbC C吸收光谱和物质的定性分析吸收光谱和物质的定性分析物质的吸收光谱与物质分子结构有关。物质的吸收光谱与物质分子结构有关。吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度（

14、Absorbance），），然后以波长（然后以波长（）为横轴，相应的吸光度（为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图，为纵轴，按结果作图，可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。在一定的温度、在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（max）。）。物质不同，它物质不同，它们的最大吸收波长也往

15、往不同。们的最大吸收波长也往往不同。不同浓度不同浓度的的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收溶液对相同波长的光的不同吸收g/mlA 550nm原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不同。相同，

16、吸收系数不同。比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定纯度鉴定)物质定性分析常用方法物质定性分析常用方法物质的定量分析物质的定量分析标准曲线法标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白溶液调节透光率时先以空白溶液调节透光率100%100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲

17、线（或称标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-CA-C曲线）。曲线）。标准管法标准管法 对个别样品进行测定，且对个别样品进行测定，且A-CA-C曲线线性良好直接比较测定结果。曲线线性良好直接比较测定结果。A标标=K标标c标标b标标 A测测=K测测 c测测 b测测 c测测=A测测/A标标 c标标分光光度计的基本构造分光光度计的基本构造仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入仪器中光源经过单色器中的单色原件（如棱镜），所得到的单色光（入射光）进入样品室，透出的光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显样品室，透出的光被受光

18、器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显示出吸光度（示出吸光度（A）或透光度（或透光度（T）。光光 源源单色器单色器样品室样品室受光器受光器测量器测量器72722 2分光光度计使用方法分光光度计使用方法接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10min;将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样品室内品室内,空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应;调好波长调好波长;

19、调节按钮调节按钮 开盖时，调开盖时，调 T 参数参数 调为调为 100 合上盖，调合上盖，调 A 参数参数 调为调为 0;逐步拉出样品室拉杆（听到逐步拉出样品室拉杆（听到“咔咔”一声），读取吸光度值一声），读取吸光度值(A）;读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。72722 2分光光度计使用注意事项分光光度计使用注意事项样品室盖应轻开轻放；样品室盖应轻开轻放；比色皿拿其磨砂面，液体装入约比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/43/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上；冲洗干净，倒置于滤纸

20、上；倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品；倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品；每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至“0”“0”。双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量实验目的实验目的了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法。蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。称为双缩脲反应。具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能

21、具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与与CuCu2+2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。质的浓度。在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。定蛋白质浓度。NHONHNHONHCCNHONHONHCC加热180 Co+NH2222223实验原理实验原理紫红色铜双缩脲复合物分子结构紫红色铜双缩脲复合物分子结构在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用

22、显色反应变成有色物质，使之能进行比在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了保证测定的灵敏度和准

23、确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下：保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下：1.选择性好，干扰少或干扰易消除；选择性好，干扰少或干扰易消除；2.灵敏度要高；灵敏度要高；3.生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定；生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定；4.生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于60nm。显色剂与显色反应显色剂与显色反应 管号管号试剂试剂 0 1 2 3 4 5 6 牛血清标准蛋白溶液（牛血清标准蛋白溶液（ml）2mg/ml 0.6

24、 1.2 1.8 2.4 3.0 0待测蛋白液（待测蛋白液（ml）3.0蒸馏水（蒸馏水（ml）3 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0未知未知实验步骤实验步骤1.1.按下图表所示加入相应的试剂或样品按下图表所示加入相应的试剂或样品2.各管混匀后加入双缩脲试剂各管混匀后加入双缩脲试剂3.0ml，充分混匀；，充分混匀；3.37度水浴度水浴30min；4.在在540nm 处以处以0号管调零点测定各管吸光度；号管调零点测定各管吸光度；5.绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标；绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标；6.对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。读数时要注意读的是读数时要注意读的是A的值；的值；注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管2/3高处）；高处）；准确记时。准确记时。注意事项注意事项