《生物安全与人类生活》转基因技术介绍-课件.ppt

1、是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，导入基因的表达会引起生物体的形状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。简称GM，指运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有变异遗传性状的物质。“”、“”、“”均为转基因的近义词。经转基因技术修饰的生物体常称为“”，简称。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品，用于医药、食品等方面。又称或，指用酶学方法，将异源基因与载体DNA载体外进行重组，将形成的重组基因转入细胞，使异源基因在其中复制表达，从而改造生物特性，大量生产人类所需

2、要的产物。符合人们要求的DNA片断，即“目的基因”；将目的基因与质粒或病毒DNA（载体）连接成DNA；把重组DNA某种细胞（受体细胞）；把能表达目的基因的受体细胞出来并使之。TTTTAAAA质粒外源DNA分子TTAATTAAAATTEcoR IEcoR IAATTTTTTAAAAligaseTTAATTAAAATT“退火”AATT转化到宿主细胞中(如E.coli)宿主细胞染色体DNA重组质粒重组质粒含有外源DNA的“工程菌”繁殖/扩增表达产物分离纯化表达产物分离纯化人类自耕种作物以来，就未停止过作物的遗传改良。过去几千年里农作物改良的方式主要是对产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自

3、然的方式积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改良。转基因技术是利用将外源基因导入生物体，是对传统技术的发展和补充，两者一脉相承，本质都是对基因的遗传改良。但在基因转移的范围和效率上有所：一般，而所转移的基因则；传统杂交和选择技术一般是在生物上进行，操作对象是，转移大量的基因，不可能准确地对某个基因进行操作和选择，对后代的表现；转基因技术操作和转移的一般是经过，功能清楚，后代表现。：农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法；：花粉管通道法农杆菌是普遍存在于土壤里的一种，在自然条件下可趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠

4、瘿瘤或发状根。和中分别含有和，其上有一段T-DNA。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA中，并且以，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。农杆菌附着到植物细胞后留在细胞间隙中。T-DNA先在细菌中被剪切、复制，然后转入植物细胞。农杆菌农杆菌包含包含Ti质粒质粒人们。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。1985年，Horsh等首先创立了农杆菌介导的烟草叶盘转化法，拓宽了农杆菌转化法的受体范围；1993年以来，以农杆菌为载体转化的禾谷类作物已有成功地报道，如水稻、玉米、大麦等。转基因多以单拷贝或数插入受体细

5、胞转入的外源基因一般是，得到的转基因植株一般是的方法、有效基因枪法最早由Cornell大学的萨Sanford提出，是的一种转化技术。基因枪根据其加速装置可分为。基因枪法成功例子几乎包括了所有禾谷类植物，如小麦、玉米、水稻、大麦等。操作简单，效率高，适应性强，一次可以向数以千计的细胞导人基因，目标命中率高；等植物的不同细胞器。转化；基因插入往往是多拷贝的，常造成基因失活或沉默；轰击过程可能造成，使插入的基因成为没有活性的片断；出现非转化体或嵌合体的可能性较高。a:带有目的基因的克隆载体；b:氯化钙沉淀法制备微弹；c:安了微弹的基因枪；d:基因枪轰击植物样品；e:转化细胞的组织培养；f:再生的转基

6、因植株该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出。在。利用花粉通道法，我国已经获得转目标基因或总DNA的植株种类有棉花、小麦、玉米、水稻、高粱、大豆、番茄、葡萄和泡桐等。外源基因，如Bt、Gus、NptII、TuMV-CP、PAT和几丁质酶基因等通过激光微束穿刺已经被导入小麦、水稻、棉花、油菜、草莓、藕、马铃薯和烟草等，并且得到稳定表达。由于通过花粉管通道法的转化可直接获得转基因种子，避免了植物组织培养过程中可能会产生的对植物基因型的依赖，和各种无法预测的体细胞变异对后代的不利影响，一般不会形成嵌合体，纯合速度快；转化速度较快，转化效率可达1%左右，一般当年即可获得转基因植株；方法简便有效，易于

7、常规育种工作者掌握，适合于大规模的农作物遗传化。工作时间受自然花期限制，必须充分了解每一种植物的开花受精的时间过程；自然田间操作，受环境条件影响很大；转基因随机方式整合进入受体染色体，转基因后代的遗传情况较为复杂；操作经验性很强；对单籽粒小花农作物的操作难度较大；获得大量的转基因种子比较困难，工作效率较低。动物转基因研究开始于，从原理及技术可分为以下3个部分：部分：克隆目的基因，分析基因的结构并在体外或其他系统中进行功能研究；部分：设计遗传修饰策略（包括载体系统的构建等），选择适当的靶细胞进行基因转移和鉴定，在此基础上将遗传修饰由细胞向整体动物过渡，实现对整体动物基因组进行人为修饰的目的；部分

8、：按育种程序进行工程动物的选育和建系，在整体动物的背景上对目的基因的功能进行详细的研究，并进一步开发利用符合设计要求的遗传工程动物。转基因动物的包括：导致产生的基因组修饰（GOF）；导致的基因组修饰（LOF），主要有插入突变、大片段缺失突变、点突变及条件性基因缺失突变；导致的基因组修饰；染色体转基因动物制备的主要方法有：。显微注射法创始人是Jaenisch和Mintz等。已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等。由美国科学家戈登等取出小鼠的受精卵，在显微镜下将胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的雄原核，然后输入假孕母鼠的输卵管中，使其着床，最终发育成转基因小鼠。Palm

9、iter等将含有小鼠金属巯蛋白基因启动子的DNA片断与大鼠生长激素基因融合，用微注射的方法导入小鼠受精卵，移植给受体，产下了21 只仔鼠，6 只比同窝仔鼠生长快，10周龄时体重比同窝正常鼠大1 倍，成功地获得了超级小鼠。哈默等人首先报道用显微注射法生产出转基因兔、羊和猪。，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。现在的转基因动物研究大都是在的基础上有所改进而进行的。继Palmiter将大鼠GH基因导入小鼠得到巨型小鼠后，牛、绵羊以及人的GH基因也先后导入小鼠，得到的转基因小鼠生长速度达到对照组小鼠的4倍。Sham用同源性猪-球蛋白的基因做启动

10、子连接入-球蛋白基因编码区，在转基因猪中高效表达出人的血红蛋白。，新西兰科学家Damak等将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF-I cDNA融合基因显微注射到绵羊原核期胚胎，移植后生出5只羔羊，其中两只（一公一母）为转基因阳性。用转基因羊与43只母羊交配，生出85只羔羊，其中43只（50.6%）为转基因阳性。羔羊在14月龄剪毛时，转基因羊净毛平均产量比其半同胞非转基因羊提高了6.2%，公羔羊产毛量提高的幅度9.2%，高于母羊3.4%。在毛纤维直径、髓质以及周岁体重方面无明显差别。外源基因的导入整合效率较高；不需要载体，直接转移目的基因；目的基因的长度可达250Kb；可以直接获得纯系，实验周期

11、短。需要贵重精密仪器；技术操作较难；外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死；整合率极低，在小鼠上获得转基因动物不到注射卵的5%，大家畜和其他动物更低；据统计，一头显微注射转基因牛大约要花费30万美元。固定吸管之内、外径分别为30、80m较为合适；定吸管内径太小会导致吸力不足，对受精卵操控不易；如太大则受精卵易受伤害，影响胚胎的存活率。显微注射针自针尖起20m处的外径为4m时，可获得良好的转染效率。注射针尖如果太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使

12、DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。显微注射所使用的受精卵固定吸管及注射针制备困难，是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。，制成高滴度的病毒颗粒，人为，也可让胚胎与能释放逆转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的目的；，被；并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下，进行表达和遗传得到转基因动物。逆转录病毒具有和在宿主细胞 DNA上的特性，一旦细胞为逆转录病毒所感染，所产生的病毒DNA在转录和整合后，即变成宿主基因组

13、的一部分，在宿主细胞中终生维持。用逆转录病毒感染早期胚胎，由于，故，。Jaenisch于1975年首次发现鼠白血病病毒(MLV)可以整合到宿主小鼠的基因组，原病毒基因可以传递给子代，但在新生动物中却几乎不表达，这成为反转录病毒转基因载体发展的一大障碍。Van der使用缺失MLV病毒LTR区增强子序列的重组逆转录病毒感染小鼠的8细胞胚胎，获得转基因小鼠，证明了逆转录病毒也许是通过LTR区增强子序列调节其基因的表达。之后Salter等用禽白血病病毒感染早期的鸡胚胎，制备了转基因鸡。传统逆转录病毒载体法的宿主范围狭窄（种属特异性，即病毒膜蛋只和特异的细胞膜受体发生作用），仅能感染分裂细胞，感染效率

14、低慢病毒能感染各种非分裂细胞，其目的基因整合至靶细胞基因组能够长期表达，免疫反应小等优点成为了研究的热点2002年，Lois等利用SIN LV携带eGFP外源基因成功感染了小鼠受精卵Pfeifer等利用类似载体感染8、16细胞的小鼠桑椹胚，成功制备了转基因小鼠 这是首次在哺乳动物中通过 LV 携带外源基因整合人宿主并有外源基因表达，整合了的外源基因可以遗传给子代（F1 代），并且在F1代中也有表达胚胎干细胞（ES细胞）是从早期胚胎的内细胞团经体外抑制分化培养建立起来的多能细胞系。通常利用一定方法如脂质体介导、电击或反转录病毒感染等，把外源基因导入干细胞中，经筛选培养，而后用于生产转基因动物。2

15、0世纪，从小鼠囊胚的内细胞团分离出了胚胎干细胞。Thomas等（）首先对小鼠ES细胞进行了，然后移植进入小鼠囊胚，将此重组胚移植进入代孕母鼠，最后产出嵌合体仔鼠，通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。基因打靶包括：基因敲除和基因敲入技术，并在研究基因功能和疾病模型研究方面作出贡献卵母细胞精子桑椹胚内细胞团胚 囊人人 胎胎 儿儿循 环 系 统神 经 系 统免 疫 系 统使用胚胎干细胞法生产转基因小鼠有3个：，1个10cm的组织培养皿可以培养105个ES细胞，且都可以用于转染试验；如果转染的是细菌的抗生素基因，如新霉素磷酸基转移酶、嚓吟霉素或者潮霉素抗性等基因，阳性ES细胞则；在经过转染、抗生素筛选

16、及冷冻保存后，。因此，使用ES细胞来生产嵌合体转基因小鼠有时候比显微注射法生产转基因小鼠更快或者。随着核移植技术的发展，可把阳性干细胞的核移入去核卵母细胞中，进一步提高转基因效率。小鼠的ES细胞系已经建立，人的ES细胞系也己经建立，但家畜如兔、猪、牛、羊的ES细胞研究进展不大，只获得一些类干细胞系。因此该方法的应用受到限制，但应用前景看好。将转基因技术与克隆技术相结合，1996年7月5日，英国爱丁堡罗斯林研究所的伊恩维尔穆特领导的科研小组，利用克隆技术培育出世界上第一只用已经分化的成熟的体细胞（乳腺细胞）克隆出的羊，被科学杂志评为1997年世界十大科技进步的第一项。在核移植前，先把目的外源基因

17、和标记基因（如LacZ基因和抗新霉素基因）的融合基因导入培养的体细胞中，通过标记基因筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100%的阳性转基因动物。Schnieke等（1997）采用此法成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因，3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50%。Cibelli（1997）利用同样方法获得3头转基因牛。McCreath等（2000）报道了用体细胞核移植生产出了绵羊。Lai等（2002）和Dai等（2002）报道了用基因打靶及克隆的方法制作出敲除1,3-糖苷转移酶的转基因猪。Kur

18、oiwa等（2004）通过敲除牛朊蛋白（PRNP）基因制作了。Yang等（2006）把体细胞核移植入源于同一母牛的去核卵子，克隆后激活的同体重组胚中基因重排要大大优于异体重组胚，解决了异体克隆胚可能由于基因印记导致的核质相互作用的不协调而导致的克隆动物效率低的问题；同体重组胚的囊胚发育率达38.5%，高于异体胚的22%；同体重组胚移植后克隆动物出生率达23%，高于异体胚的5.6%。刘忠华等（2008）对猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选，以绿色荧光蛋白（GFP）基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体，以体外成熟卵母细胞为核受体，构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎，将重构胚移植于受体，在

19、国内首次通过体细胞核移植技术得到GFP阳性转基因克隆猪，并首次发现通过核移植路线生产的转基因动物具有嵌合基因型，即仅在肌肉组织中无目的基因。目前影响克隆技术的应用是由于其效率低，随着去核方法、供体细胞和受体卵母细胞的融合效率、激活、以及重建胚培养等技术水平的提高，有学者认为转基因动物克隆技术将有望成为21世纪创建遗传工程动物的主导技术。精子载体法是将精子作为外源基因的载体，在受精过程中将外源基因导入动物胚胎，并使外源DNA整合到染色体中，从而使外源基因进入子代的基因组中以精子为载体介导的基因转移主要通过以下途径来实现的：分精子与外源DNA直接共孵育法、体外电穿孔导入法和脂质体转染法：又分为输精

20、管注射转染法、曲细精管注射转染法、睾丸注射转染法等，Bracket等首次证实精子具有吸附结合外源DNA能力，并将外源DNA在受精时携带进入卵母细胞，Lavitrano等应用此法得到阳性转基因小鼠，并发现成熟精子头部具有吸收外源DNA的能力，其吸收区域是具有特异性的，位于精子头部的顶体后区，即靠近精核的区域沈新明等（）直接用人CMV启动子调控的增强型GFP表达载体注射到小鼠的曲精细管内，最后通过与雌鼠交配，成功获得了表达GFP的转基因仔鼠袁进等（）报道向通过向曲精细管内注射外源DNA，结合对曲精细管电击或电穿孔处理，使外源基因进入睾丸生精细胞，然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配，得到的小鼠中有一组的

21、阳性检测率达25%Shen等（）将方法简化，直接向雄兔睾丸内注射携带GFP表达的外源DNA及DMSO的介质，使DNA进入睾丸细胞和生精细胞；一个月后与雌兔交配，所产生后代的56%仔兔能高效地表达所导入的外源基因 李碧春等（）以重组GFP基因为标记，首次采用公鸡睾丸内转染精原干细胞和体外转染SSCs再移植的方法成功地生产出转基因鸡，并在家鸭和家鸡上转染功能基因进行验证。迄今已在12种动物中获得了转基因后代，包括小鼠、家兔、牛、猪和鸡等精子载体法利用精子的自然属性克服人为机械操作给胚胎造成的损伤，具有简便易行、耗费低、转染率高和适应性广等特点 外源基因随机整合；无法利用此法随意地获得理想的转基因动

22、物精子载体法中精子孵育前的预处理通常使精子的受精能力下降，于是许多学者尝试借鉴医学上的辅助生殖技术ICSI使处理精子受精。精子胞质内显微受精技术是。它降低了对精子各种指标的要求，使各种在体内外不可能发生正常受精的卵子受精，同时可以避免多精子受精，也为研究异种间受精提供了有效的途径。美国科学家Perry等首次应用ICSI技术成功地获得了转基因小鼠；随即研究者们分别在猕猴、猪上进行ICSI转基因尝试，胚胎转基因阳性率也很高，但最终并没有得到出生的转基因动物。2006年Kurome等把精子与携带有人白蛋白（hALB）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的 DNA序列片断共孵化，通过 ICSI方法生产的胚

23、胎移植后生产出一头含有hALB和GFP基因的转基因小猪。胞浆内单精子注射仍需显微操作，但与原核注射相比很多；一些（如牛、羊、猪），ICSI能体现出技术上的优势；再有，精子注射针的尖端截面积约为显微注射针的100倍左右，尤其适合基因组DNA、BAC或YAC库、DNA大片段操作同时ICSI法还具有、多精受精率低、排除透明带和卵质膜对精子入卵的阻碍作用，其受精率不受精子浓度、形态和活力的影响等一系列优点 通过该方法生产转基因动物，仍许多问题有待解决卵母细胞是一种全能细胞，可随着细胞分化、胚胎发育，把基因组所贮存的全部遗传信息扩大到生物体所有的细胞中采用受精卵前卵母细胞作为外源基因的导入点，让目的基因

24、比精子染色质先进入卵细胞，这样只要发生外源基因的整合，其后的受精卵分裂、直至发育成为成熟的个体，每一个细胞就肯定携带外源基因，避免了嵌合体动物的产生Carballada等（）对脂质体介导外源基因在体外转染卵母细胞和胚胎进行初步研究，证明这是一条简单有效的转基因途径Jonathan等（）发现卵巢中存在卵原干细胞，将外源基因整合到卵原干细胞中，可获得整合有外源基因的卵子，受精后可获得整合有外源基因的动物Yang等（）直接对小鼠的卵巢注射绿色荧光蛋白基因，得到转基因小鼠，后代阳性率达54%，并发现6代以内的转基因小鼠都具有较好的遗传稳定性同样方法制作转基因鸡，阳性率高达67.65%通过性腺转基因，操

25、作简便、技术要求较低、难度较小，将成为制作转基因动物的一个方向,有可能用于如猪和牛这样的大动物的转基因。仍然存在外源基因随机整合进入宿主基因组的问题，还无法利用此方法随意地获得理想的转基因动物。1982年Neumann.E将外源DNA在电场条件下导入小鼠真核细胞，从而实现了基因重组和外源基因的功能研究。随之这一技术得到广泛应用：细菌、酵母、植物和动物细胞的体外应用；器官植入、皮肤损伤修复的电化学疗法、疫苗的注射等体内体外临床应用；小分子或大分子物质功能性研究；研制转基因动物、转基因植物新品种等。电电穿穿孔孔前前后后细细胞胞质质膜膜的的变变化化示示意意图图 电穿孔技术主要包括电转染和电融合：是利

26、用脉冲电场将外源DNA导入细胞中，当细胞处于高压电场时，瞬时电脉冲可将细胞膜穿孔产生可逆性孔径，从而DNA进入细胞与染色体整合；是利用高强度的电场脉冲，引起相邻的细胞融合。电穿孔原理和应用示意图电穿孔原理和应用示意图 这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。转移效率较低，仅有15%的外源DNA可以进入受体细胞核中，仅约1%的DNA可以在细胞中稳定表达。将需转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方

27、法转基因效率高。基因基因表达产物表达产物选择剂选择剂抗生素类抗生素类 neo基因 tpt基因 博莱霉素抗性基因除草剂类除草剂类 csr1-1基因 aro A基因 tfd A基因代谢试剂类代谢试剂类 dhfr基因新霉素磷酸转移酶潮霉素磷酸转移酶结合蛋白乙酰乳酸合成酶5-烯醇丙酮莽草酰-3-磷酸合成酶2,4-二氯苯氧乙酸-氧化物酶二氢叶酸还原酶卡那霉素、新霉素潮霉素博莱霉素氯磺隆草甘膦2,4-D甲氨蝶呤目前是利用抗生素、除草剂抗性基因作为选择标记基因进行筛选，但，这些和多余甚至是有害的。包括：标记基因通过花粉和种子等途径在，可能转移到杂草，产生抗除草剂的“超级杂草”；，从而对生态环境和生物多样性产

28、生潜在的危害；在健康领域，标记基因及其产物，标记基因可能被转移到人或动物的肠道微生物或上皮细胞，从而降低抗生素在临床治疗中的有效性。目前主要有：一是利用。已发现的生物安全标记基因有绿色荧光蛋白基因、甜菜醛脱氢酶基因、6-磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因、核糖醇操纵子等。二是转化时使用标记基因，。去除转基因作物中标记基因主要采用共转化、位点特异重组酶系统、转座子和同源重组等方法。三是利用。直接观察转基因赋予生物的外表特征，包括发芽测定、纸巾测定和生物测定。前两种主要用于分析转基因作物对除草剂的耐受性质，后者检查杀虫能力。以产物蛋白作为抗原与相应抗体的免疫反应PCR法，由于许多转基因结构都被列

29、为商业机密，给引物设计带来困难质谱分析、毛细管电泳、近红外光谱、DNA芯片、光纤生物传感器药物、疫苗、基因治疗转基因植物、动物基因工程菌替代凝乳酶生产奶酪三次采油工艺：采用转基因技术构建能产生大量二氧化碳和甲烷等气体的工程菌，在油层中产生气体增加压力，而且分泌高聚物、糖酯等表面活性剂，降低油层表面张力使原油从岩石、沙土中松开，提高采油量；纤维素酶乙醇；氢气紫色硫细菌基因高效降解杀虫剂和除草剂的基因工程菌；抗汞污染的转基因烟草；降解卤代芳烃、尼龙寡聚物的工程菌；清除石油污染的基因工程菌主要农作物的病虫害逐年增加高产品种需肥量大水资源日趋缺乏盐碱地等限制了种植与产量主要农作物品质差且产量有限食品安全争议生物富集争议药食关系争议生态影响争议基因污染争议全球监管争议机遇泡沫争议基因工程安全管理办法1993科技部新生物制品审批办法1999农业部农业转基因生物安全管理条例2001农业部农业转基因生物进口安全管理办法2001农业部农业转基因生物标识管理办法2001农业部农业转基因生物安全评价管理办法2001农业部农业转基因生物进口安全管理程序2002农业部农业转基因生物标识审查认可程序2002农业部农业转基因生物安全评价管理程序2002农业部进出境专业产品检验检疫管理办法2004质检总局开展林木转基因工程活动审批管理办法2006林业局农业转基因生物加工审批办法2006农业部