扫描电镜生物样品制备技术.ppt

1、生物、医学、动物、材料、生物、医学、动物、材料、化学、化学、物理、地质、冶金、矿物、污泥物理、地质、冶金、矿物、污泥(杆菌杆菌)、机械、电机及导电性样、机械、电机及导电性样品如半导体电子材料等品如半导体电子材料等材料学土聚水泥材料学土聚水泥 制备扫描电镜样品的总要求制备扫描电镜样品的总要求 在不损伤样品原始结构状态在不损伤样品原始结构状态的情况下，保证样品的体积和表的情况下，保证样品的体积和表面积不发生改变，充分暴露样品面积不发生改变，充分暴露样品表面的微细结构表面的微细结构。扫描电镜生物样品要求扫描电镜生物样品要求：不含水份不含水份 具有较高的二次电子发射率具有较高的二次电子发射率 良好的导

2、电性良好的导电性 耐热性耐热性 最大限度的保持样品的形貌最大限度的保持样品的形貌 1.取取 材材 2.清清 洗洗 3.固固 定定 4.脱脱 水水 5.干干 燥（燥（置换置换）6.粘粘 托托 7.镀镀 膜（导电处理）膜（导电处理）一、一、要要 点：点：确定观察样品的目标确定观察样品的目标要求及注意事项：要求及注意事项：做好充分准备（试剂、仪器、器械等）做好充分准备（试剂、仪器、器械等）保护观察面，作好标记保护观察面，作好标记 速度要快速度要快，每次取材数量不宜过多，每次取材数量不宜过多 大小要合适大小要合适 10 10 5毫米毫米 避免拉割、挤压避免拉割、挤压二、二、目的：去除观察面的杂质，充分

3、暴露观察面目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面方法：物理方法方法：物理方法:漂洗、换洗、加压冲洗、漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声振荡超声。化学方法化学方法:用酶消化法用酶消化法注意事项：注意事项：在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型三、三、固定固定目的：目的：保存样品表面的真实结构；保存样品表面的真实结构；硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品的损伤

4、；的损伤；提高样品的二次电子发射率；提高样品的二次电子发射率；提高样品的耐热性和导电性。提高样品的耐热性和导电性。常用的固定剂：常用的固定剂：2.5%戊二醛戊二醛（13h)1.0%四氧化锇四氧化锇(301h)固定温度：固定温度：室室 温，一般以温，一般以4为宜。为宜。四、脱水四、脱水 要求：不改变样品的体积和表面积的情况要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。下，去除样品中的水份。常用的脱水剂：乙醇、丙酮常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水方法：梯度脱水时间：视样品大小而定时间：视样品大小而定注意事项：避免裸露，夹伤注意事项：避免裸露，夹伤五、五、目的：去除样品中的脱水

5、剂目的：去除样品中的脱水剂 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、方法：空气干燥法、冷冻干燥法、叔丁醇干燥法、叔丁醇干燥法、临界点干燥法等临界点干燥法等常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法（1）乙醇梯度脱水至）乙醇梯度脱水至100/2次次 （2）叔丁醇与乙醇混合液置换至叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇叔丁醇 70、80、90、95和和 100/2次次 5-10min/次次（3）在样品表面滴上）在样品表面滴上 100%叔丁醇叔丁醇（4）将标本置于）将标本置于4以下使样品快速固化以下使样品快速固化（5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。）移入镀膜仪中让样品在

6、真空下升华干燥。临界点干燥法临界点干燥法 原理原理：利用物质在临界状态时，气相与液相：利用物质在临界状态时，气相与液相 的界面消失，样品在没有表面张力的的界面消失，样品在没有表面张力的 情况下进行干燥。情况下进行干燥。步骤步骤：脱水：脱水 置换置换（醋酸异戊酯）（醋酸异戊酯）预冷预冷 放入样品放入样品 注入液态注入液态CO2 CO2置换置换 CO2加温气化加温气化 排除排除CO2温度温度：31.4度度压力压力：73个大气压个大气压临界点干燥法临界点干燥法空气干燥法空气干燥法 Comparison between critical point drying and air drying 六、六、

7、粘托粘托 SEM样品在干燥处理样品在干燥处理或金属镀膜之前，需用特或金属镀膜之前，需用特制导电胶或双面胶将样品制导电胶或双面胶将样品粘贴在金属样品台上。粘贴在金属样品台上。导电胶一般具有黏着导电胶一般具有黏着力较强、容易挥发固化、力较强、容易挥发固化、干燥后表面电阻率低、导干燥后表面电阻率低、导电性能好等特点。电性能好等特点。要点：稳，钝角要点：稳，钝角样样 品品 粘粘 托托Fixing the specimen 七、镀膜七、镀膜（样品的导电处理）（样品的导电处理）目的：使样品导电，增加二次电子的发射率目的：使样品导电，增加二次电子的发射率金属镀膜技术：包括金属镀膜技术：包括真空喷镀法真空喷镀

8、法和和离子溅射法离子溅射法真空喷镀法真空喷镀法 方法方法：在高真空中使金属加热蒸发，在：在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金属膜。样品表面沉积形成一层金属膜。缺点缺点：金属损耗大，容易产生污染和热：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成损伤，容易形成“死角死角”。离子溅射法离子溅射法原理：原理：利用气体在低真空中的辉光放电所产生的利用气体在低真空中的辉光放电所产生的高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与在到达样品

9、前，金属粒子之间以及金属粒子与气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒子飞向样品的方向，具有子飞向样品的方向，具有“绕射绕射”效应，所以效应，所以在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金属膜。属膜。离子溅射的优点：离子溅射的优点：要求的真空低要求的真空低 工作温度低工作温度低 金属粒子无方向金属粒子无方向 连续的、厚度均匀连续的、厚度均匀 甲甲 虫虫 3kV大肠杆菌耳蜗尿酸钠结晶尿酸钠结晶红细胞红细胞巨噬细胞吞噬巨噬细胞吞噬上左：兔肾小体细胞上左：兔肾小体细胞上右：血细胞发生上右：血细胞发生下图：十二指肠绒毛下图：

10、十二指肠绒毛 TRRT T.harzianum(T)寄生在立枯絲核菌寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形菌株上的情形 特殊生物样品制备主要有：特殊生物样品制备主要有：（1）管道铸型样品）管道铸型样品 （2）冷冻断裂样品）冷冻断裂样品 （3）游离细胞样品）游离细胞样品 （4）组织消化样品）组织消化样品2 冷冻断裂样品冷冻断裂样品 用于实质性脏器内部组织结构的研究，观用于实质性脏器内部组织结构的研究，观察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间的关系。的关系。步骤：取材步骤：取材 固定固定 清洗清洗 防冻防冻 冷冻冷冻 包埋包埋 割断割断 软化软化 后固定后固定

11、 导电导电 及终末固定及终末固定 脱水脱水 临界点干燥临界点干燥 镀膜镀膜 观察观察要求：取材迅速要求：取材迅速，大小为，大小为1 1 5mm，用具要用具要 预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要 快，外力要轻快，外力要轻3 游离细胞样品游离细胞样品样品制备要点：样品制备要点：将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、固定固定步骤：预固定步骤：预固定 离心离心 涂片涂片 固定固定 脱水脱水 干燥干燥 镀膜镀膜血细胞血细胞4 组织消化样品组织消化样品 用化学腐蚀或酶消化方法，来充分用化学腐蚀或酶消化方法，来充分暴露和显示被检样品结构的表面形态。暴露和显示被检样品结构的表面形态。步骤：步骤：固定固定 清洗清洗 消化消化 表面稳定表面稳定 后固定后固定 脱水脱水 干燥干燥 镀膜镀膜 观察观察谢 谢！谢 谢！