细菌感染的分子生物学检验课件.pptx

1、湖南省中医药大学生化与分子生物学教研室Jake Li临床分子生物学检验临床分子生物学检验第九章第九章 细菌感染的分子生物学检验细菌感染的分子生物学检验细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体，并在机体中生长繁殖，产生毒素或其他代谢产物所引起的全身性感染，临床上以寒战、高热、关节疼痛等为特征，部分患者还可以出现烦躁、四肢厥冷、发绀、呼吸加速、血压下降、感染性休克等临床症状。传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质（RNA或DNA），从而达到早期、快速、敏感、特异地检

2、测已经成为临床检验的主流技术之一。第一节第一节 细菌感染的分子生物学检验策略细菌感染的分子生物学检验策略分子生物学检验是以核酸（DNA或RNA）或蛋白质分子为检验目标，通过检查人体内源基因或外源（病原体）基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法和过程。机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和耐药性监测。一、细菌感染的一般性检出策略一、细菌感染的一般性检出策略细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分子生

3、物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有无细菌感染和是何种病原体感染。二、细菌感染的完整性检出策略二、细菌感染的完整性检出策略完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断，还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原体的相关信息。第二节第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验结核分枝杆菌的分子生物学检验结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口广泛流动等因素，全球范围内结

4、核病的疫情死灰复燃。据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中的5%10%携带者可发展为活动性结核病。TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚集成团，用抗酸性染色被染成红色。对养要培求特殊条件，一般要经4-6周才出现肉眼可见的菌落。TB通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜侵入机体，它被吞噬后能在吞噬细胞内繁殖，导致巨噬细胞裂解，还可在细胞外繁殖。TB的培养特点：馋、懒、丑。馋馋-营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些

5、无机盐类的特殊培养基（罗氏）上才能生长良好。懒懒-生长缓慢，1418h分裂1次，在固体培养基上25w才出现肉眼可见的菌落。丑丑-典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。TB具有合成所有必需氨基酸、维生素和酶辅助因子的潜在能力。该菌具有代谢各种各样碳水化合物、乙醇、酮和羧酸的能力。此外，还具有许多涉及脂代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸和乙醛酸循环所必须的酶分子。结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包括水解酶或者药物修饰酶，例如乙

6、酰转移酶和很多药物外排泵系统。抵抗力特点：“三耐四敏”耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000）对湿热、70乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长期使用易产生耐药性）变异性 典型形态多形性 R型菌落S型菌落 有毒无毒（用于制备疫苗）抗结核药敏感耐药目前结核杆菌常规检测方法目前结核杆菌常规检测方法痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广泛的交叉，特异性不强。TB H37Rv 全基因组为环状双链DNA，长约4 411 529bp，共有4000基因，G+C平均值65.6%，其基因

7、序列高度保守。H37Rv 基因组中有50 个编码功能RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定（stable）RNA基因，这些 RNA分子是由特异的核糖体RNA 操纵子产生的。一、结核分枝杆菌的基因组结构特征一、结核分枝杆菌的基因组结构特征在H37Rv 全基因组中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个拷贝的IS1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区，通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分布在重复区。TB H37Rv 基因组中共有3924个开放阅读框，其中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始密码子61%为ATG，35%为G

8、TG。187个ORF参与脂类代谢、细胞壁合成，360个参与细胞壁代谢，66个参与脂类合成，287个参与能量代谢，95个参与氨基酸合成，38个与细菌毒力相关，69个参与DNA合成。所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。TB不同菌株之间存在多个差异基因。基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容（一）（一）结核分枝杆菌核酸的检测结核分枝杆菌核酸的检测可采用PCR、real-time PCR、

9、PCR-RFLP、线性探针杂交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验、基因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的TB DNA。1、PCR PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色体DNA的重复序列等。常规PCR的不足：产物的交叉污染、假阳性、假阴性、实验室污染。2、real-time PCR 与传统PCR相比，具有敏感度、特异性高及方便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓慢的结核杆菌的检测更有优势。3、PCR-RFLP 通过PCR扩增分枝杆菌染色体上一段DNA，将扩增产物经限制性内切酶消化（最常用的内切酶是Pvu)，

10、将消化的样品进行琼脂糖凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性。4、线性探针杂交 其原理是应用生物素标记的特异引物进行靶核酸的扩增，将产物变性后与固定在尼龙膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法显示结果，一次杂交可以检测多种靶序列。简便、快速、敏感。5、链替代扩增技术（SDA）SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术。基本原理：引物与靶DNA序列上对应的DNA单链杂交，在聚合酶作用下产生带Hinc识别位点含5和3端的靶DNA序列，该靶序列进入DSA循环；Hinc限制性核酸内切酶切割识别位点，依赖DNA聚合酶在切割处延伸3端，并替代另一条DNA链；

11、该替代链与引物杂交后又依次作为另一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复，使靶DNA序列呈指数性增长；37 40进行23次循环后，2h内靶序列可得到108扩增放大。SDA法以IS6110和16SrRNA基因为扩增靶点。6、扩增结核分枝杆菌直接试验（AMTDT）AMTDT以结核分枝杆菌的16SrRNA为扩增模板，采用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化学发光物吖啶酯标记的cDNA探针与扩增的靶基因杂交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验除去未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学发光信号。AMTDT方法具有高度的敏感性特异性。对涂片阳性TB诊断的敏感性达到92%100%，对所有

12、临床标本检测的特异性均在95%以上，因此具有极大的临床应用价值。7、基因芯片技术、1999年 Troesch 等开发出首块结核病相关芯片，包括两部分，一部分是在结核分枝杆菌有种间的多态性的16SrRNA 基因片段，借以鉴别结核杆菌与非结核杆菌；另一部分则用于分析耐利福平菌株rpoB基因突变的发生情况，可用于结核分枝杆菌对利福平耐药性的快速检测。8、GeneXpert全自动结核检测平台将样品前处理、核酸提取、PCR检测和结果分析等全过程结合在一起，最大程度上提高检测自动化和灵敏度。XpertMTB/RIF，通过六重荧光定量PCR对结核分枝杆菌和利福平耐药性进行快速检测。（二）结核分枝杆菌的耐药性

13、检测（二）结核分枝杆菌的耐药性检测结核分枝杆菌耐药的分子机制是由于结核杆菌的特定基因某些碱基出现突变（插入、缺失、替换）而造成。1、结核分枝杆菌的耐药机制、结核分枝杆菌的耐药机制（1）耐利福平分子机制：）耐利福平分子机制：是由于其作用靶标结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶亚单位的编码基因（rpoB）突变所致。当rpoB中507533位密码子的核心区域耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，使DNA依赖RNA聚合酶亚单位酶结构改变利福平不能与细菌的RNA聚合酶亚单位结合而表现为耐药。其中以编码531位氨基酸的碱基TCGTTG和编码526位氨基酸的碱基CACTAC的突变最常见。（2）耐异烟肼分子机制：）

14、耐异烟肼分子机制：结核杆菌耐异烟肼与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(katG)、烯酰基还原酶编码基因(inhA)、烷基过氧化氢酶还原酶编码基因(ahpC)、2S酮酰基酰基运载蛋白合成酶编码基因(kasA)有关。主要是katG基因的点突变、缺失、插入，完全缺失占异烟肼耐药菌株的7%24%，主要出现于高水平耐异烟肼分离株中，随机突变占50%70%，常见的点突变是315位AGCACC和463位CGGCTG。inhA基因突变约占异烟肼临床耐药株的10%35%。耐药的发生可由于inhA结构基因突变造成异烟肼与DADH的亲和力下降，或是inhA启动子-15的CT的点突变可能创造一个强有力的启动，使inhA

15、蛋白过度表达从而提高对异烟肼活性形式所需的浓度，引起对异烟肼耐药，inhA基因的突变常出现低水平异烟肼耐药性。（3）耐氨基糖苷类药物分子机制：耐链霉菌的结核杆菌主要由于编码核算糖体16S rRNA的rrs基因与编码核糖体蛋白S12的rpsL基因发生突变，从而降低了氨基糖苷类药物结合到核糖体上的能力，形成耐药。rpsL基因中编码第43位氨基酸的碱基AG的突变是常见的突变位点出。Rrs基因突变点为512、513位的碱基插入，这些碱基突变均可导致高水平的耐药。（4）耐吡嗪酰胺分子机制：吡嗪酰胺需经结核分枝杆菌体内的吡嗪酰胺酶催化才能转变成具有活性的吡嗪酸。耐吡嗪酰胺主要由 pncA 基因突变所造成的

16、吡嗪酰酶的蛋白结构改变，失去了将吡嗪酰胺转换成活性形式的能力，形成耐药。（5）耐乙胺丁醇分子机制：耐乙胺丁醇主要与操纵子cmbB基因有关，cmbB突变导致糖基转移酶结构，影响乙胺丁醇和糖基转移酶的结合而产生耐药，其中第306位密码子的错义突变最为常见。（6）耐氟喹诺酮类药物分子机制：氟喹诺酮类药物主要靶位是结核杆菌的DNA旋转酶，该酶由gyrA和gyrB两种基因编码的两个A亚单位和两个亚单位组成。其中编码的gyrA基因发生突变则导致氟喹诺酮类药物结合位点构象改变，从而产生耐药性。突变大多数发生在gyrA基因保守区67106位密码子区，常见有94位GACGCC或CAC或TAC，90位GCCGTG

17、的突变。2 2、结核分枝、结核分枝杆菌耐药性检测的分子生物学技术耐药性检测的分子生物学技术（1）DNA测序：该技术是检测基因突变的金标准，不仅可用于突变的筛选，而且能确定突变碱基的部位和分布。（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）PCR-ROB（5）基因芯片技术三、分子生物学检验的临床意义三、分子生物学检验的临床意义传统的结核病的临床诊断主要是根据病史、细菌培养、涂片抗酸染色找TB、免疫学方法检测TB抗原或抗体、胸片等可对大多数患者做出正确的临床诊断，但对部分病人可造成误诊或漏诊。分子生物学方法为TB的临床诊断提供了一种快速、准确的诊断方法，具有以下特点：1、在TB感染早期，特别是

18、在 TB 病灶通过血源性外传播时及在外周血中存在极少量的TB 时，分子生物学方法能通过体外扩增进行确诊。而早期诊断在临床诊疗中具有重要的指导意义，可以防止继发性TB病灶的形成。2、PCR检测TB仅需24小时，克服了传统TB培养方法需时间长、痰涂片检查阳性率低的缺点，提高了临床检测的敏感性和特异性。3、可以通过分子生物学技术进行结核耐药的早期快速检测，为临床诊疗提供快速、准确的结核耐药信息，有效指导临床抗结核用药。4、有利于疾病的鉴别诊断，对于肺结核来说，其中的结核球和成人原发型结核等经常易于同肺癌的诊断相混淆。病灶中心经常出现既未见TB又末见癌细胞的坏死区。此时涂片检测常是阴性，利用分子生物学

19、检测技术就能够进行鉴别诊断。5、抗结核治疗的评价，通过分子生物学技术可以通过定期检测，评价抗结核药物的疗效及残存菌的数量和活性度。第三节第三节 淋病奈瑟菌的分子生物学检验淋病奈瑟菌的分子生物学检验淋球菌又名淋病奈瑟菌（淋球菌又名淋病奈瑟菌（NG），是淋病的病原），是淋病的病原菌。淋球菌革兰染色阴性，是严格的人体寄生菌。淋球菌革兰染色阴性，是严格的人体寄生菌，常存在于急性尿道炎和阴道炎的脓性分泌菌，常存在于急性尿道炎和阴道炎的脓性分泌物的白细胞中，形态染色类似于脑膜炎球菌。物的白细胞中，形态染色类似于脑膜炎球菌。人类是淋球菌唯一的自然宿主，淋病主要由性人类是淋球菌唯一的自然宿主，淋病主要由性接触

20、而传播。淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖，接触而传播。淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖，男性发生尿道炎，女性引起尿道炎和子宫炎。男性发生尿道炎，女性引起尿道炎和子宫炎。如果治疗不彻底，可扩散至生殖系统。如果治疗不彻底，可扩散至生殖系统。女性出女性出现前庭大腺炎和盆腔炎等，是导致不育原因之现前庭大腺炎和盆腔炎等，是导致不育原因之一一.胎儿可经产道感染造成新生儿淋病性急性结胎儿可经产道感染造成新生儿淋病性急性结膜炎。人类对淋球菌膜炎。人类对淋球菌直接涂片染色镜检 采取尿道脓性分泌物涂片，革兰氏染色镜检，如在中性粒细胞中发现革兰氏阴性双球菌时，就有诊断价值。该方法敏感度和特异性差，尤其是在女性患者中检出率仅为5

21、0%左右，不能用于确认；分离培养法 是临床诊断淋病奈瑟菌(NG)感染的金标准,但该方法对标本和培养营养要求高，培养周期长，出临床报告慢，难以满足临床需要。免疫学方法 由于分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体方法间的稳定性和条件限制，使推广应用受限。淋球菌感染的确认主要依靠实验室检查。目前，实验室淋球菌感染的确认主要依靠实验室检查。目前，实验室诊断淋球菌感染的方法有：诊断淋球菌感染的方法有：一、淋病奈瑟菌的基因组结构特征一、淋病奈瑟菌的基因组结构特征淋病奈瑟菌FA1090菌株的染色体DNA长度为2.15Mbp，其中G+C含量为52.68%。编码区的DNA长度占总长度的78%。包括2002个具有

22、编码功能的基因和67个编码结构性RNAS基因。NCCP11945菌株的染色体DNA长度为2.23Mbp，据估计可以编码2622个开放性阅读枢。同时，NCCP11945含有1 个能编码12个ORFS的质粒。整个基因组的编码基因的密度为87%。全基因组平均G+C含量为52.4%，这与FA1090菌株相类似。二、淋病奈瑟菌的分子生物学检验内容二、淋病奈瑟菌的分子生物学检验内容（一）淋病奈瑟菌核酸的检测（一）淋病奈瑟菌核酸的检测1、PCR 是淋病奈瑟菌基因诊断中最基本的方法。PCR引物选择的靶基因多采用：隐蔽质粒ccpB基因(ccpBHO1/3、1/2及ccpBN3/4);16SrRNA基因(SL67

23、/59、NGP1/2)；porA假基因；编码外膜蛋白基因（omp基因）；opa基因；胞嘧啶DNA甲基转移酶基因。2 2、实时荧光定量、实时荧光定量PCRPCR技术技术目前临床检测NG的主要的分子生物学技术。3 3、连接酶链反应、连接酶链反应用于LCR方法检测的NG靶基因主要有opa基因和Pilin基因。对咽拭子标本具有很好的敏感性，但应注意避免污染导致的假阳性抑制物所致的假阴性。4 4、链替代扩增技术、链替代扩增技术特异性扩增NG染色体PivNg基因，然后用荧光标记的探针检测其相对应的DNA靶序列。（二）淋病奈瑟菌的耐药性检测（二）淋病奈瑟菌的耐药性检测1、淋病奈瑟菌的主要耐药基因、淋病奈瑟菌

24、的主要耐药基因gyrA和和parC基因：基因：DNA 旋转酶是氟喹诺酮类药物作用的靶位，由 gyrA 和parC 基因编码，gyrA基因突变可导致酶结构的改变，阻止氟喹诺酮类药物进入靶位，引起耐药。gyrA基因突变与淋球菌低水平和中度水平氟喹诺酮类药物耐药有关，而对氟喹诺酮类药物高水平耐药是gyrA和parC共同参与基因突变的结果，gyrA和parC 是氟喹诺酮耐药决定区（QRDR）中的两个重要基因。(2)penA(2)penA、ponAponA基因：基因：青霉素结合蛋白青霉素结合蛋白(PBP(PBPS S)为淋球菌重要的外膜蛋白。编码为淋球菌重要的外膜蛋白。编码PBPPBPS S的基因主要有

25、的基因主要有PenAPenA、PonAPonA基因，如果上述基因中基因，如果上述基因中发生突变，就会导致发生突变，就会导致PBPPBPS S结构的改变，使结构的改变，使PBPPBPS S与青霉素与青霉素的亲和力下降，细胞膜对青霉素的渗透性降低的亲和力下降，细胞膜对青霉素的渗透性降低，细菌产，细菌产生耐药性。生耐药性。(3)porB(3)porB基因：基因：孔蛋白是镶嵌在淋球菌外膜的主要蛋白，与细菌的侵袭孔蛋白是镶嵌在淋球菌外膜的主要蛋白，与细菌的侵袭力有关，此外还具有物质运输功能。主要由力有关，此外还具有物质运输功能。主要由porBporB基因编基因编码，如果发生基因突变，导致码，如果发生基因

26、突变，导致孔蛋白孔蛋白120120与与121121位氨基酸位氨基酸的改变的改变，最终导致孔蛋白，最终导致孔蛋白对亲水性抗生素渗透性下降对亲水性抗生素渗透性下降，使药物在细胞内使药物在细胞内蓄积不足蓄积不足，从而产生耐药性。，从而产生耐药性。(4)Mtr(4)Mtr系统调控基因：系统调控基因：MtrRMtrR调控基因的突变，导致它编码的调控基因的突变，导致它编码的MtrRMtrR阻遏蛋白阻遏蛋白减减少少或或消失消失，MtrMtr操纵子的操纵子的转录增强转录增强，使，使 MtrCDE MtrCDE 基因基因的的表达增加表达增加，编码的泵蛋白，编码的泵蛋白外排活性增加外排活性增加，加大，加大脂溶脂溶

27、性抗生素的排出性抗生素的排出，使菌体内药物，使菌体内药物蓄积不足蓄积不足，从而导致，从而导致耐药。耐药。(5)erm(5)erm基因：基因：ermerm基因编码基因编码ermerm酶，如果发生突变，酶，如果发生突变，ermerm基因编码基因编码的酶可以使的酶可以使rRNArRNA自动甲基化自动甲基化，从而使，从而使大环内酯类药大环内酯类药物物作用靶位作用靶位核糖体核糖体50S50S亚基蛋白改变亚基蛋白改变，使药物与靶，使药物与靶位位亲和力下降亲和力下降引起耐药引起耐药2、淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术（1）DNA测序：测序：目前应用该技术进行检测的淋病奈瑟

28、菌耐药基因主要目前应用该技术进行检测的淋病奈瑟菌耐药基因主要有有gyrA基因、基因、parC基因、基因、erm基因等。基因等。（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）基因芯片技术）基因芯片技术三、分子生物学检验的临床意义三、分子生物学检验的临床意义1、克服了淋球菌培养时间长等缺点，提高了临床标、克服了淋球菌培养时间长等缺点，提高了临床标本检测的阳性率和准确性。本检测的阳性率和准确性。2、通过分子生物学技术可以进行淋球菌感染的流行、通过分子生物学技术可以进行淋球菌感染的流行病调查。病调查。3、可以准确、快速评价药物治疗的效果。、可以准确、快速评价药物治疗的效果。4、有利于淋病的鉴别诊断

29、。、有利于淋病的鉴别诊断。第四节第四节O157型大肠埃希菌的型大肠埃希菌的分子生物学检验分子生物学检验感染性腹泻是世界范围内重要的公共卫生问题，其主要菌型是肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7，其产生强有力的细胞毒素志贺菌样毒素Stx1和（或）Stx2。其主要作用部位是右半结肠，在盲肠、阑尾和升结肠引起黏膜的充血、水肿和细胞变性坏死，甚至血性腹泻，严重者可以导致死亡。E.coliO157:H7引起的出血性结肠炎是1982年在美国俄勒岗州和密执安州，因食用汉堡包引起的食物中毒的病人粪便中被分离并命名的。据美国疾病控制中心(CDC)报告，每年全国约发现2万多例病人。死亡人数200-500人，以后陆续

30、在全球五大州20多个国家被发现或引起暴发和流行。自82年发现至今，发生规模最大的一次爆发是97年5月下旬，日本冈山、广岛等县几十所中学和幼儿园相继发生6起集体食物中毒事件，人数多达1600人，导致3名儿童死亡，住院儿童达80人。同时日本仙台和鹿儿岛形成中毒人数过万人，死亡11人，波及44个都府县的爆发性食物中毒，引起全世界的关注。此外美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、苏格兰、威尔士等国家和地区也相继报道了EHEC的散发性感染和暴发流行。我国自1986年徐州首次分离O157:H7以来，福建、甘肃、浙江、江苏和安徽等省市相继从人和动物中分离出O157:H7。1999年在江苏淮北部分地区及邻近的安徽部分

31、地区发生的O157:H7感染暴发，患者超过2万人，死亡177人，流行长达7成个月，被认为是迄今为止世界范围内规模最大、死亡人数最多、时间最长、发病原因最复杂的一次。一、一、O157型大肠埃希菌的基因组结构特征型大肠埃希菌的基因组结构特征大肠埃希菌的基因组由一个环状染色体和大质粒组成。O157:H7 EDL933株，有1387种大小不同的可能的至病基因，编码可能的致病因子、选择性新陈代谢能力和一些原噬菌体及新功能基因；有21个特异性序列，编码溶血素、菌毛、侵袭性相关蛋白及铁、脂肪和糖代谢相关的因子等；O157:H7 Sakai株与非致病的实验株E.coli K-12 MG1655株的全基因组序列

32、进行比较。O157:H7 Sakai株染色体大小为55Mb，比K-12大895kb，两者有约4.1Mb的高度保守序列。O157:H7 Sakai株染色体中包含5361开放阅读框架，其中3729个ORF存在于K-12中，其余1632个ORF在K-12中不存在。1632个ORF中有873个ORF的功能是已知的，369个ORF与未知功能的蛋白质相似，其余ORF则是O157:H7 Sakai株特有。除了环状染色体外，O157:H7 Sakai还含有一个分子量约为93kb的特异性大质粒pO157，该质粒与细菌的致病力密切相关。O157:H7 EDL933菌株的pO157完整DNA序列是由复制区和保守区结

33、构上的致病基因序列组成，并且有7个插入序列。在鉴定100个ORF中，19个为可能的致病基因，42个与已知功能的蛋白相似。二、二、O157型大肠埃希菌的分子生物学检验内容型大肠埃希菌的分子生物学检验内容1、聚合酶链反应、聚合酶链反应 PCR是最常用的检测大肠埃是最常用的检测大肠埃希菌希菌O157:H7致病基因的方法。主要检测的靶基因主要有stx1、stx2、eae、chxA和ssa基因等。2、PCR-RFLP3、环介导恒温扩增4、基因芯片技术第五节第五节医院细菌感染的分子生物学检验医院细菌感染的分子生物学检验院内感染院内感染是指住院患者在医院内获得的感染，包括在住院期间发生的感染和在医院内获得而

34、出院后发生的感染；但不包括入院前已开始或入院时已处于潜伏期的感染。医院的工作人员在医院内获得的感染也属院内感染。各种微生物都可引起医院感染，其中细菌最为常见，特别是多重耐药菌的感染。根据病原体的来源分类 可将院内感染分为内源性和外源性感染。1、内源性感染：又称自身感染，是指各种原因引起的患者在医院内遭受自身固有病原体侵袭而发生的院内感染。病原体通常为寄居在患者体内的正常菌群，通常是不致病的，但当个体的免疫功能受损、健康状况不佳或抵抗力下降时则会成为条件致病菌发生感染。2、外源性感染：又称交叉感染，是指各种原因引起的患者在医院内遭受非自身固有的病原体侵袭而发生的感染。病原体来自患者身体以外的个体

35、、环境等。包括从个体到个体的直接传播和通过物品、环境而引起的间接感染。医院细菌感染主要表现的几个特征：医院细菌感染主要表现的几个特征：易感人群免疫能力低下，细菌感染死亡率高；医院中细菌病原体来源广泛、外环境污染较严重，容易导致交叉感染；医院中流行的细菌菌株大多为多重耐药，治疗难度大。医院细菌感染的常用分子生物学检验技术医院细菌感染的常用分子生物学检验技术（1）脉冲砀凝胶电泳（）脉冲砀凝胶电泳（PFGE）（2）PCR-RFLP（3）扩增限制性长度多态性分析（）扩增限制性长度多态性分析（AFLP）（4）重复序列）重复序列PCR（Rep-PCR）（5）随机扩增多态性）随机扩增多态性DNA技术（技术（RAPD）（6）多点位测序分型（）多点位测序分型（MLST）分子生物学技术在医院感染中的作用分子生物学技术在医院感染中的作用（1）确定医院细菌感染的暴发流行；）确定医院细菌感染的暴发流行；（2）医院感染与感染复发的鉴别。）医院感染与感染复发的鉴别。