细胞培养.ppt

1、细胞培养基础知识 陈鹏鹏概念狭义 群体培养广义 还包括克隆培养 群体培养 克隆培养体外培养细胞的分型贴附型 必须贴附于支持物表面才能生长悬浮型 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面 成纤维细胞 上皮型细胞 游走细胞型（单核巨噬细胞）多型细胞型（神经细胞）外周血单个核细胞细胞的生长和增殖过程(1)培养细胞生命期(三个阶段)：a.原代培养或初代培养期 从体内取出的组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周b.传代期 原代培养的细胞一经传代后便改称细胞系，在全生命期中此期的持续时间最长，在培养条件较好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。c.衰退期 在此期间细胞开始时虽仍然存活，但

2、增殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡(传代3050次以后)(2)每代细胞的生长过程a.滞留期：包括游离期及潜伏期 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮态，也称为悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min4h。潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624h。b.指数增生期：又称对数期。此期间细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞生长增殖状况可以依据细胞倍增情况(细胞群体倍增时间)及细胞分裂指数等来判断。(35天)c.生长停止期(平顶期)：此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生

3、长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。基本培养技术 原代培养取材解剖或解离组织块接种机械法消化法胰蛋白酶胶原酶EDTA溶液 传代培养消化传代不消化传代 针对悬浮生长和半悬浮生长a 吸光培养瓶中的培养液b 加适量的胰酶，待细胞间隙加大、快变圆时加血清中和c 用吸管吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液d 离心，弃上清加培养液e 分装接种，放入培养箱冻存和复苏 原则：慢冻快融 复苏的方法（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化 （1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心3-10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。无菌培养 工作环境和设备

4、 常用的培养器皿的清洗消毒 操作技术方面 整个操作过程要迅速敏捷但不能过快，以免形成气流。超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口。开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯的烧灼，并在火焰附近工作。吸取培养液、DPBS或其它试剂是注意换管，防止交叉污染或污染扩大。使用培养液前，不宜较早开启瓶口。不在使用的培养液应立即封口。培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中。操作时不要交谈、咳嗽，以防止唾沫和呼出气流引发污染。操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。注意事项 1、实验进行前，超净台紫外灯照射30-60分钟灭菌，以75%酒精擦拭无菌操作台

5、面，并开启无菌操作台风扇运转几分钟后，才开始实验操作。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%酒精擦拭超净台面。操作间隔应让无菌操作台运转15分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、移液枪等可以放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以75%酒精擦拭后才带入超净台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、定期检测下列项目：a.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染。b.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。c.水盘的水用无菌水，定期更换水槽的水。4、粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月。5、一定要注意CO2培养箱的卫生，培养基放入后升温，容易在培养瓶身上吸附大量细菌。