HIV核酸检测技术及应用（可编辑的）课件.ppt

1、HIV核酸检测技术及应用核酸检测技术及应用目目 录录nHIV核酸简介nHIV核酸检测意义nHIV核酸检测技术现状与发展nHIV核酸检测质量控制nHIV核酸检测流程（新规范）nHIV核酸检测实例应用HIVHIV病毒病毒 病毒颗粒病毒颗粒：呈球形，直径100-120nm 病毒衣壳病毒衣壳：呈20面体立体对称 病毒核心病毒核心：由RNA（两条ssRNA）、核衣壳蛋白、逆转录酶、核糖核酸酶及整合酶所组成HIV RNAHIV生活周期图HIV前病毒前病毒DNAHIVHIV感染的自然史感染的自然史急性感染期急性感染期无症状期无症状期艾滋病期艾滋病期HIVHIV感染感染后标志物变化时间后标志物变化时间Reac

2、tivity012345678Weeks post-infectionHIVHIV核酸检测的意义核酸检测的意义HIV核酸核酸缩短窗口期指导治疗自然史艾滋病的“元凶”病程耐药性HIVHIV核酸检测的意义核酸检测的意义nHIV-1感染诊断感染诊断婴儿感染早期诊断（小于18月龄）HIV-1感染补充试验及急性期和晚期感染者的诊断n治疗效果监测治疗效果监测 通常在治疗一个月后病毒载量降低0.5log以上才被认为临床治疗有效，六个月后应降到小于检测限n病程监控及预测病程监控及预测n耐药性监测耐药性监测HIVHIV核酸检测技术核酸检测技术分为HIV定性和HIV定量检测两大类：HIVHIV定性检测定性检测：H

3、IV核酸（RNA和前病毒DNA）的检测HIVHIV定量检测定量检测：又称HIV病毒载量检测（Viral load），主要用于抗病毒治疗患者的疗效评价，也可用于补充试验（新规范）HIVHIV核酸定性检测核酸定性检测uIN-HOUSE（文献报道）uRoche Amplicor HIV-1 DNA PCR,v1.5试剂盒(已停产)uRoche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test,v2.0u雅培RealTime HIV-1定性检测试剂盒uHIV病毒储存库的检测技术（超敏PCR）In-houseIn-house普通普通PCRPCR诊断方

4、法诊断方法核酸提取核酸提取PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR扩增扩增电泳鉴定或测序电泳鉴定或测序HIV-1HIV-1的基因组结构的基因组结构结构蛋白结构蛋白酶类酶类衣壳蛋白衣壳蛋白9.2kb 检测设计：分别针对HIV gag、env和pol的三个独立PCR检测体系，并另外设立1个检测内参（-actin）的检测体系（国家艾滋病参比实验室）阳性阳性：扩增出人-actin，HIV-1 gag、env和pol基因中扩增出2个及以上基因片段阴性阴性：扩增出人球蛋白基因，HIV-1 gag、env和pol 3个基因都没有扩增出来不确定不确定：人球蛋白基因未扩增出预期的片段或HIV-1 gag、env

5、和pol 3个基因只扩增出一个In-houseIn-house普通普通PCRPCR诊断方法诊断方法“套式套式”PCRPCRAAAAAA53gag pol envReverse primer 1Forward primer 1第一轮第一轮PCR 产物产物Reverse primer 2Forward primer 2第二轮第二轮PCR 产物产物优点优点:增加敏感性增加敏感性/特异性特异性缺点缺点:增加扩增偏差机会增加扩增偏差机会 需要增加操作过程需要增加操作过程 容易增加污染机会容易增加污染机会琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳-actingagenvpolIn-house In-house 荧光荧光

6、PCRPCR 国内外文献报道以HIV RNA或前病毒DNA作为检测目标，选择LTR、gag、pol等基因作为靶基因，建立荧光PCR检测方法0102030405060050000100000150000200000ADeltan RnCycle Number FAM CY501020304050600100000200000300000400000BDeltan RnCycle NumberFAMCY5HIV核酸阴性核酸阴性HIV核酸核酸阳性阳性罗氏罗氏HIV-1 Qual TestHIV-1 Qual Test 基于COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48平台，用于HIV

7、-1 RNA和前病毒DNA的定性诊断，检测样本类型包括抗凝全血、血浆、血清、干血斑或干浆斑等The COBASThe COBAS AmpliPrep/COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan TaqMan HIV-1 HIV-1 Qualitative Test,v2.0Qualitative Test,v2.0Dual-PCR target Assay designgaggag:Targeted in previous Roche HIV-1 tests Large sequence database from Roches Global surveillance progr

8、amNot a drug target todayLTR:LTR:Targeted in Roche MPx blood screening testNot a drug target today检测总核酸（DNA/RNA）检测结果示例检测结果示例阴性阳性阳性HIVHIV核酸定量检测核酸定量检测nHIVHIV病毒载量病毒载量(Viral Load)(Viral Load)n指体内复制的病毒的数量，反映体指体内复制的病毒的数量，反映体液（一般是血浆）中液（一般是血浆）中HIVHIV病毒的含量病毒的含量n1987年John首次提出病毒载量（viral load）的概念，体内复制的病毒的数量是不能直

9、接测量的，一般用血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。n是是HIVHIV核酸的定量检测，一般以血浆核酸的定量检测，一般以血浆HIV RNAHIV RNA的拷贝数的拷贝数/ml/ml表示表示常用的常用的HIVHIV病毒载量检测方法病毒载量检测方法n主要核酸扩增核酸扩增和信号放大扩增信号放大扩增两种方法nNASBA/Easy Q(Biomerieux,生物梅里埃)nCobas Amplicor/Taqman(Roche，罗氏)nm2000(Abbott，雅培)nbDNA/Versant 440(西门子)n国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万泰 丽珠、科华等NucliSENS E

10、asyQ血浆样本miniMAGeasyMAG病毒载量分析仪引物引物 2 2NASBANASBA扩增技术扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依赖性扩增法）逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶T7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶逆相逆相 RNA RNA 扩增物扩增物RNase HRNase H引物引物 1 1引物引物1 1 延伸延伸 RNase HRNase H 和和引物引物 2 2延伸延伸 RNARNAT7 RNA T7 RNA 聚合酶聚合酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶“分子分子信标信标”杂杂交交AMV-RT(鸟肉瘤病毒逆转录酶)

11、:延伸形成RNA-DNA 杂交链 RNase H:降解杂交链中的RNAT7-RNA聚合:转录形成的RNA转录产物T7T7启动子序列启动子序列COBASCOBAS AmpliPrep AmpliPrep/COBAS/COBAS TaqMan48 TaqMan48COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48 系统完整探针完整探针:报告基团报告基团(R)的的荧光被淬灭基团荧光被淬灭基团(Q)抑制抑制h h 引物引物引物引物R RQ Q探针被探针被5-外切核酸酶切掉外切核酸酶切掉Q QR R报告基团的荧光发射报告基团的荧光发射h h Q QR RR=报告基团报告基团 Q=淬灭基团淬灭基

12、团 TaqMan水解探针技术水解探针技术雅培雅培HIV-1HIV-1病毒载量仪病毒载量仪m2000m2000全自动实时荧光定量全自动实时荧光定量PCRPCR系统系统HIV-1病毒载量自动化检测平台（96通量）已认证用于干血斑病毒载量检测婴儿HIV-1核酸检测试剂盒用于实验室in-house方法的自动化核酸提取此平台同时有HBV病毒载量，HCV病毒载量及分型，HPV高危分型，MTB检测，CT/NG检测等试剂盒bDNAbDNA(Bayer versantTM)核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！人工加样试剂分装自动化提取人工配液PCR仪检测临床式半自动使用方案北

13、京万泰生物药业股份有限公司北京万泰生物药业股份有限公司PCR仪结果导入WanTag 全自动核酸提取仪PCR检测HIV核酸定量检测试剂-全自动化平台强强联合整合Tecan加样与Thermo核酸提取平台高通量 同时可用，实现1h内96份样本的提取 高自动化可自动完成包括加样、核酸提取与纯化、PCR试剂配制与分配等扩增前的所有操作采磁棒转移技术，有效避免气溶胶污染中文自主操作界面，方便快捷达安基因HIV病毒载量核酸检测系统HIV-1核酸定量检测试剂盒全自动核酸提取仪DA3200国产化！全自动！PANTHER系统TMA（转录介导的等温扩增）简易的工作流程：“上样”直接到“结果”，3.5小时得到第一个样

14、本结果，每分钟一个结果，12个小时500个样本核酸检测在新版规范主要内容核酸检测在新版规范主要内容u新增补充试验的概念，补充试验包括抗体确证试验和核酸试验（定性和定量试验）u新增核酸检测流程，对复检结果有反应的情况，增加了可以选择核酸诊断的策略；对于HIV抗体确证结果不确定和疑似急性期感染的样品建议采用HIV-1 核酸试验。u修改了艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期感染检测流程补充试验（核酸试验）补充试验（核酸试验）初筛初筛+复检复检+HIVHIV定性检测试剂盒定性检测试剂盒 试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。全球目前正式用于临床诊断HIV-

15、1 急性期感染的核酸检测试剂比较少nGen-Probe 公司生产的Aptima HIV-1 RNA 核酸定性试剂盒nAbbott公司生产的M2000 HIV-1 RNA/DNA 定性检测试剂盒nRoche公司生产的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test,v2.0HIVHIV核酸定性检测核酸定性检测 适应范围（1）诊断婴儿早期感染（2）诊断急性HIV-1感染。针对对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流行病学史的个体,或确证结果不确定的样本,核酸定性检测可用于诊断HIV-1急性期感染。（3）确定艾滋病病毒感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或

16、确证结果不确定的个体，结合流行病学史和临床病史，核酸定性检测可用于HIV-1感染诊断。艾滋病晚期患者可能出现HIV抗体反应不确定，可根据HIV核酸定性检测结果，结合临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等情况，进行综合判断，确定临床诊断。结果判读与报告结果判读与报告n检测结果显示“有反应”或“检测到”，报告“HIV-1核酸阳性核酸阳性”；检测结果显示“无反应”或“未检测到”，报告“HIV-1核酸阴核酸阴性性”。n核酸定性检测值低于最低检测限的结果，不能排除HIV-1感染，需根据流行病学史、临床病史和实验室相关指标进行综合判断。n目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂HIVHIV定量检测的试剂盒

17、定量检测的试剂盒 试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。nNASBA/Easy Q(Biomerieux,生物梅里埃)nCobas Amplicor/Taqman(Roche，罗氏)nm2000(Abbott，雅培)nbDNA/Versant 440(西门子)n国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万泰 丽珠、科华等HIVHIV核酸定量检测核酸定量检测 适用范围（1）监测抗病毒药物治疗效果。抗病毒药物治疗前后，定期病毒载量分析和监测，结合CD4+T淋巴细胞计数，有助于抗病毒药物治疗方案的确定和修改。（2）监测疾病进展。定期检测HIV-1病毒载量

18、，有助于监测感染者和病人的病程变化，结合CD4+T淋巴细胞计数，为抗病毒药物治疗提供病毒学依据。（3）诊断急性HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流行病学史的个体，或确证结果不确定，核酸定量检测可用于诊断HIV-1急性期感染。（4）确定HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确定的个体，结合流行病、和临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等，使用核酸定量检测帮助确定HIV-1感染。结果判读与报告结果判读与报告n用于治疗效果和病程监测用于治疗效果和病程监测：检测值小于试剂盒线性范围下限，报告低于检测限，检测值大于等于试剂盒线性范围下限，按照检测值报告。n 用于用于HIV-1

19、感染的诊断感染的诊断：检测值5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值；检测值5000 CPs/ml(或IUs/ml)，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，报告检测值，结果5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值，结果仍5000 CPs/ml，则需充分结合流行病学史、临床病史、CD4+T淋巴细胞计数和HIV-1抗体随访检测结果等进行综合判断检测值低于最低检测限不能排除HIV-1感染。（注：目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂；由于核酸定量检测方法获得的低病毒检测值可能是核酸污染所致的结果，根据国内外的相关数据和报道，建议用5000 CPs/ml作为判断结果的阈值

20、，两次定量检测有助于准确判断结果）。集合核酸定性检测集合核酸定性检测 （Pooling PCRPooling PCR）n对高危人群抗体检测阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期HIV-1 感染者；用于血液筛查可进一步降低“残余危险度”n该方法较单份样品的核酸检测具有更高的成本效益。集合集合PCRPCRHIV HIV 核酸即时检测核酸即时检测(POCT)(POCT)nHIV 核酸即时检测是在发病或者发生事件的地点进行检测，能快速获得检测结果并及时反馈一线医务人员的一类检测方法。nPOCT 检测适用范围广泛，且可避免样本长途运输导致的质量下降，非专业人员经培训后也可操作。n可用于HIV-1

21、感染、儿童早期HIV 感染的辅助诊断、疾病监控及抗病毒药物疗效评价。HIVHIV病毒载量的即时检测病毒载量的即时检测1 1HIVHIV病毒载量的即时检测病毒载量的即时检测2 2质量保证和质量控制质量保证和质量控制人员实验室分区和环境仪器设备质量控制检测过程质量控制外部质量控制实验室分区和环境实验室分区和环境 HIV-1 病毒载量检测实验室原则上应分为三个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。严格要求三区的空气流向：从试剂准备区到样品处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。试剂准备区样品处理区扩增产物分析区样品加样全自动检测系统（核酸提取、试剂配置和扩增检测）仪

22、器设备质量控制仪器设备质量控制n加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次；冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，并做好记录。n要定期对HIV-1 病毒载量检测仪、实时荧光PCR 仪等仪器进行维护保养。检测过程质量控制检测过程质量控制n试剂盒有效并经国家食品药品监督管理总局注册，使用无DNA和RNA酶的水；严格执行仪器和试剂的SOP，不得擅自修改。nHIV-1 核酸定性检测每次实验建议加阳性对照、阴性对照和试剂对照。n定量检测每次实验使用试剂盒提供的内部质控品（内标），并满足内部质控品的要求；建议使用一个HIV-1 RNA 为500015000 cps/毫升的外部质控品。外部质量控制外部质量

23、控制PT样品组成：每次5份，包括阴性、不同拷贝数的阳性样品。PT频率：一年2次。PT样品的接收与保存：接受考核样品后填写接收专用单，-70度以下保存。PT样品的检测：要求将考核样品同实验室常规样品一起检测，由常规检测人员进行。PT结果的报告和处理：在规定的时间内上报实验结果。PT评分原则 将参与实验室反馈结果换算成对数值（Lg），再按同一种方法与同一个考核品的的所有实验室结果进行统计，算出平均值（M）和标准偏差（S）。成绩判定成绩判定n根据每个参与考核实验室一年两次所有考核品的结果进行综合评分（每一个考核品的评判标准依照A与B条款），判定标准为：优秀：所有考核品没有问题；良好：有一个考核品满足

24、A中的条款；合格：两个考核品满足B中的条款 不合格：至少有三个考核品满足A中的条款或至少一个考核品出现B中的条款。nA条款：样品结果在M+2.0S M+3.0S内；样品结果在M-2.0S M-3.0S内；考核结果报告没及时上报；没按要求上报原始记录。nB条款：样品结果超过M+3.0S；样品结果M-3.0S；假阳性；假阴性；无效结果。应用实例应用实例1 1窗口期病例n某年某月某疾控送检一份HIV筛查阳性标本（MSM）。nELISA阳性，硒标阳性WB确证gp160,p24。n两周后随访，ELISA阳性，硒标阳性，WB确证gp160,p24。病毒载量51000 cp/ml。n一月后再抽血复检，ELI

25、SA阳性，硒标阳性，WB确证gp160,gp120,p66,p51,gp41,p31,p24,p17。HI病毒载量120000cp/ml。应用实例应用实例2 2晚期AIDS病人样本某年某月，某医院送检一份疑似HIV感染的样本，有机会感染的住院病人。第一次检测ELISA阴性，报HIV抗体阴性。临床医师要求确证试验，第二次检测，ELISA和硒标均为阴性，WB：gp160,p66,p51，不确定。病毒载量7500 IU/ml。CD4:9个/l一个月后复检ELISA和硒标仍为阴性，WB：p24,p51,p66，病毒载量164000 IU/ml。有艾滋病的临床表现，结合临床表现最终临床诊断为艾滋病。进行

26、抗病毒治疗一月内此病人已死亡应用实例应用实例3 3婴幼儿早期诊断n某婴儿2012年8月出生，双亲均为HIV感染者，孕3月行母婴阻断n44天第一次核酸检测为阳性n177天第二次核酸检测为阳性n出具”婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性”应用实例应用实例4 4抗体假阳性病例n某病例未经过抗病毒治疗未经过抗病毒治疗，硒标阳性（某国产金标为阴性），酶联阳性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB条带（gp160,gp120）,病毒载量检测TNDn1个月随访后硒标阳性，硒标、酶联阳性，WB条带（gp160,gp120）,病毒载量检测TND应用实例应用实例5 5抗病毒治疗病例n某病例抗病毒治疗史不详抗病

27、毒治疗史不详，硒标阳性（某国产金标为阴性），酶联阳性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB条带（gp160,gp120）,病毒载量检测TNDn抗体的假阳性 VS 抗体的真阳性？HIVHIV核酸检测用于诊断的局限性核酸检测用于诊断的局限性1 1n若检测目标是HIV 的RNA核酸容易受抗病毒药物的影响而检测不到n接受抗病毒治疗，HIV抗体确证实验不确定的样本面临诊断的困境复制后复制后的大量的大量新病毒新病毒释放到释放到血液中血液中HIVHIV病毒储藏库存在方式病毒储藏库存在方式 59环状环状线性线性整合型整合型病毒病毒DNADNA有有三种存在方式三种存在方式储藏库病毒处于静止状态储藏库病毒处

28、于静止状态;细胞内整合的细胞内整合的HIV-1 DNA;HIV-1 DNA;细胞活化后能够释放病毒细胞活化后能够释放病毒CD45RO+/CD2CD45RO+/CD25-/CD69-5-/CD69-/HLA-DR-/HLA-DR-HIV“治愈治愈”定义定义n完全治愈：完全治愈：体内完全清除可复制的病毒nA sterilizing cure would involve total elimination of all replication-competent HIV from the body.n功能性治愈：功能性治愈：病毒未完全清除，不治疗、不复制、不进展nFunctional cure,th

29、e virus may not have been completely eliminated but no HIV replication is detectable and individuals experience no disease progression in the absence of antiretroviral treatment.n缓解：缓解：不治疗、病毒低水平(50 copies/mL)nRemission,the latest definition to enter the HIV cure dialog,refers to control of HIV viral

30、 load at low levels(such as below 50 copies/mL)in the absence of treatment.相关研究（内外）：相关研究（内外）：Mississippi Child2013 CROI(March 3-6,2013)n诊断：诊断：2个独立个独立HIV检测检测n第第30小时核酸定性检测小时核酸定性检测（阳性（阳性）n第第31小时载量检测小时载量检测（20,000拷贝拷贝/ml）功能性治愈Mississippi Child疗效疗效 EfficacyHIV RNA LDL (within 1m HIV RNA LDL 18、23-26 mHIV

31、DNA fragments(+)HIV-specific antibodies(-)功能性治愈功能性治愈Mississippi Childn密西西比儿童：密西西比儿童：2014 CROI n41月龄，停药22月以后，依然维持功能性治愈VL LDL(LDL=20 c/ml，停药，停药23个月个月)HIV RNA 1 c/ml(停药停药22个月个月)No replication-competent resting CD4 cell latent reservoir virusproviral DNA+(22个月个月)Very early treatment forms a barrier to t

32、he formation of HIV reservoirs in perinatal infection.尽早治疗可阻断围产期感染尽早治疗可阻断围产期感染HI V形成储存库形成储存库解决对策解决对策nAbbott公司生产的M2000 HIV-1 RNA/DNA 定性检测试剂nRoche公司生产的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test,v2.0（HIV-1 RNA/DNA）使用针对HIV DNAHIV DNA或者或者RNA/DNARNA/DNA检测试剂盒HIV 超敏PCR试剂盒海力特科技，服务精准医疗1.HIV-1 DNA定量检测

33、试剂盒2.HIV-1 总核酸（RNA+DNA）检测试剂盒3.HIV-1 Integrated DNA（前病毒）定量检测试剂盒4.HIV-1 RNA定量检测试剂盒5.HIV-1 spliced mRNA检测试剂盒6.HIV-1 2-LTR检测试剂盒HIVHIV核酸检测用于诊断的局限性核酸检测用于诊断的局限性-2-2u目前的HIV核酸检测试剂盒只针对HIV-1型，且主要覆盖其中的M组u目前还没有针对HIV-2型的核酸检测试剂盒79PHIVHIV核酸检测用于诊断的局限性核酸检测用于诊断的局限性-2-2产品1：覆盖HIV-1型的所有M组亚型产品2：可覆盖HIV-1 M、O、N组各个亚型产品3：检测HI

34、V-1 M群中所有亚型及O、N和P组大多数亚型HIVHIV核酸检测用于诊断的局限性核酸检测用于诊断的局限性-3-3u每个HIV核酸检测试剂盒都有其检测限，如：20cps/ml，50 cps/ml，100 cps/ml。低于检测限不能排除HIV感染。u检测限根据上样体积变化而变化NucliSENS EasyQ HIV-1 v2.0NucliSENS EasyQ HIV-1 v2.0NucliSENS EasyQ HIV-1 v2.0总总 结结uHIV核酸试验作为补充试验可弥补HIV抗体确证的不足uHIV核酸试验的高敏感性可缩短窗口期，有利于发现急性期感染者uHIV核酸试验阴性不能排除HIV感染，HIV RNA核酸试验容易受抗病毒治疗影响，应用时应特别注意！应建立病毒储存库的检测方法。谢谢 谢！谢！