流式细胞仪--教材课件.ppt

1、流式细胞仪流式细胞仪1.1.流式细胞术概述流式细胞术概述 2.2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述3.3.流式细胞仪系统结构流式细胞仪系统结构4.4.流式细胞仪软件介绍流式细胞仪软件介绍目目 录录5.5.流式细胞仪其它流式细胞仪其它1.流式细胞术概述流式细胞术概述1.1.流式细胞术概述流式细胞术概述流式细胞术定义流式细胞术定义流式细胞术发展史流式细胞术发展史流式细胞术特点流式细胞术特点1.流式细胞术概述流式细胞术概述1.流式细胞术定义：流式细胞术定义：l流式细胞术(Flow Cytometry，FCM或 FACS)：是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量

2、分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。l流式细胞术是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术,它是集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。1.流式细胞术概述流式细胞术概述2.流式细胞术发展史：流式细胞术发展史：1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究；1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞；1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利；1950

3、年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos,NM发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂大量厂家不断生产流式细胞仪1.流式细胞术概述流式细胞术概述3.流式细胞术特点：流式细胞术特点：分析对象：单细胞悬液或生物颗粒分析速度：快速，最高达上万个细胞/秒检测参数：多参数（两个散射光参数、多个荧光参数）可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球芯片技术

4、（Cytometric Beads Array,CBA）检测结果：精度高、准确性好先进的细胞定量技术2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述流式细胞仪定义流式细胞仪定义流式细胞仪的发展史与商品化流式细胞仪的发展史与商品化流式细胞仪的生产厂家流式细胞仪的生产厂家流式细胞仪的分类流式细胞仪的分类BDBD公司、公司、BeckmanBeckman公司的分析仪及分选仪外观公司的分析仪及分选仪外观2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述贝克曼库尔特贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪流式细胞仪2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述1.流式细胞仪定义：流式细胞仪定义：流式细胞仪(Flow Cyto

5、metor,FCM)是以流式细胞术为核心技术，对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等。2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述2.流式细胞仪的发展史与商品化：流式细胞仪的发展史与商品化：1953年：Parker 和 Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏型；1969年：Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计；1970年：Phywe研制脉冲细胞光度计，备有荧光镜的FCM，DNA定量；同年Kamensky发明白细胞分类流式细胞仪，激光光源，吖啶橙染色，测定淋

6、巴、单核、中性粒C；1972年：Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分选仪（FACS），氩离子激光，标志着流式细胞仪商品化时代到来；1973年：Becton Dikinson(BD)公司投入市场，第一台FACS-问世，其后20多年来不断改进完善产品，先后推出FACSAnalyzer、FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-、FACSVantage、FACSDiva、FACSAria等；1975年：Kochler 和 Milstein 提出单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础；鉴于商业仪器的发展;2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述19

7、83年：Shapiro 认为多参数分析流式细胞仪可以实现。此后，流式细胞仪进入一个快速发展的时期；1994年：美国Cytomation公司推出高性能、高速分选装置MoFlo，该机以出色的性能和创新设计理念，一经推出即受到广泛关注；2008年：美国BD公司推出Influx，在MoFlo基础上实现了原位、立体分选。2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述4.流式细胞仪生产厂家：流式细胞仪生产厂家：l目流式细胞仪生产厂家主要有 BD、Beckman Coulter、Partec、Guava、Union Biometrica、ABI、Amnis 等等。l美国 BD、Beckman Coulter 和德国的 P

8、artec 占领着流式细胞仪市场的统治地位。lBD、Beckman Coulter 产品型号种类齐全，占市场份额较大，如：经济普及型流式细胞仪：FACSCount、Cytomics FC500；大型科研型流式细胞仪：BD FACSAria、EPICS；特点：产品价格昂贵，我国使用的单位基本上是科研机构。lPartec 产品结构紧凑，造价低，便于携带，适合边远地区和发展中国家，在植物学的研究中占有较大份额。Partec 公司的 CyFlow 于2004 年 1 月进入太空站用于研究工作，成为世界上首台升上太空的流式细胞仪，证明其结构紧凑，性能优越的特点。2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述5.流式细

9、胞仪分类：流式细胞仪分类：l临床型：光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易掌握，适用于临床常规测试；l科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器，可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上，适用于科研。2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述BD公司的流式细胞公司的流式细胞分析仪分析仪2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述BD公司的流式细胞公司的流式细胞分选仪分选仪2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述Beckman公司的流式细胞公司的流式细胞分析仪分析仪2.流式细胞仪概述流式细胞仪概述Beckman公司的流式细胞公司的流式细胞分选仪：分选仪：3.流式细胞仪系统结构流式细胞仪系统结构3.流式细胞仪系统结构流式细胞

10、仪系统结构流动室与液流系统流动室与液流系统激光光源与光学系统激光光源与光学系统信号检测与分析系统信号检测与分析系统分选系统分选系统3.流式细胞仪系统结构流式细胞仪系统结构流流 式式 细细 胞胞 仪仪 结结 构构 图图3.流式细胞仪系统结构流式细胞仪系统结构u1.流动室和液流系统流动室和液流系统n流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交n液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器3.流式细胞仪系统结构流式细胞仪系统结构n流动室：流动室：l流动室由样品管、鞘液管和喷嘴样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作l样品管样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管

11、射出;l鞘液鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出;l流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。3.流式细胞仪系统结构流式细胞仪系统结构流体的流体的动力学动力学聚焦聚焦3.流式细胞仪系统结构流式细胞仪系统结构n液流系统：液流系统：l由样本和鞘液组成l待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流l鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。l为了保证液流是稳液，一般限制液流速度50005000人工，人工，200200结果结果多参数，综合分析多参

12、数，综合分析简单，单参数简单，单参数流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用 流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用l在肿瘤学中的应用l在血液学中的应用l在免疫学中的应用l在细胞凋亡检测中的应用流式细胞仪性能技术指标流式细胞仪性能技术指标流式细胞仪性能技术指标流式细胞仪性能技术指标流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选样品浓度、分选/分选速度及纯度分选速度及纯度等。荧光分辨率荧光分辨率：指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数变异系数（CV 值）来表示。现在市场上主流型号的荧光分辨率小于 2.0%，有的甚至在 1%之内；荧光灵敏度：荧光灵敏度：反映了仪器探测最小荧光光强的能力，一般用荧光微球上可测出的荧光（FITC）的最小分子数来表示。目前仪器可以达到 1000左右；样品浓度：样品浓度：仪器工作时样品浓度的适用范围一般在1010细胞/ml的数量级；分析分析/分选速度：分选速度：分析速度一般为 5000-10000 个细胞/s，分选速度控制在 1000 个细胞/s 以下，分选纯度 98%。参考资料参考资料参考资料参考资料谢谢谢谢!