溶菌酶教学讲解课件.ppt

1、.1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12菌株酶酶的类型作用对象分子量等电点最适pHF1内肽酶金葡55k5.37.0S-35F2Ch型金葡10.07.0-8.0H-402C型变链23k9.56.0(c.w)P-51C型铜绿19k9.8E1Ch型金葡11.8k8.5-10W ardE2Ch型金葡13.5k107.81988链球葡萄球8-10.5.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.27.28.29.30.31.32.33图1-1 RX-17发 酵液对变链球菌I n g b r i t t 的溶 菌 曲 线00.10.20.30.40.5

2、0.60.70.80.9036912151821242730t/minO.D580.34 表1-1 RX-17发 酵 液 对 变 链 球 菌Ingbritt的 平 板 溶 菌 结 果稀 释 倍 数 1 2 4 8 16 32 64溶 菌 圈 直 径(mm)26.3 24.0 20.7 18.8 15.8 12.8 9.6.35 表 1-2 RX-17 发酵液作用变链球菌 Ingbritt 不同时间时的溶菌率作用时间(min)0 1 3 6 10 15 21 30O.D580 0.765 0.734 0.628 0.513 0.395 0.324 0.296 0.282溶菌率(%)0 23.6

3、47.3 68.8 87.2 93.8 96.1 98.4.36 表 1-3 RX-17 发酵液与卵清溶菌酶对几种常见细菌的作用比较 酶活力(U/mL)底物细菌 RX-17 发酵液 卵清溶菌酶 (1000U/mL)溶壁微球菌 59.1 588大肠杆菌 48.3 0枯草芽孢杆菌 11.5 35.5金黄色葡萄球菌 233 0变链球菌 Ingbritt 185 0.37图1-2 RX-17生长与产酶曲线-生 物量 -酶 活 力 -p H05010015020001224364860728496 108 120t/h酶活力(u/mL)0246810121416生物量(m g/mL)&pH.38图 1-

4、3 添加S.mutans细胞壁时R X-1 7与 S186 的产 酶 曲 线-S186对 照组 -S18 6 添 加 细 胞 壁 组-RX-17对 照组 -RX-1 7添 加 细 胞 壁 组020406080100120140160180200024487296120144t/h酶活(u/mL).39.40.41.42 表 1-6 RX-17 生理生化实验结果试 验 结 果明胶液化 -牛奶凝固与胨化 胨化，不凝固淀粉水解 +纤维素分解 -产 H2S 试验 +硝酸盐还原 +利用酪氨酸产色素 +.43碳源 利用情况 碳源 利用情况葡萄糖 +麦芽糖 +蔗糖 +半乳糖 +果糖 +甘露糖 +木糖 +水杨

5、苷 -甘露醇 +鼠李糖 +乳糖 +阿拉伯糖 +蜜二糖 -棉子糖 +山梨醇 +肌醇 +纤维二糖 +菊糖 +纤维素 -.44.45.46.47gi|10038674|dbj|AB045866.1|AB045866 Streptomyces griseus subsp.griseus gene for 16S rRNA Length=1485 Score=2849 bits(1437),Expect=0.0 Identities=1447/1449(99%),Gaps=1/1449(0%)Strand=Plus/Plus.48 碳源 蔗糖2%单因子实验氮源 蛋白胨1%+酵母膏0.2%无机盐0.7%的

6、NaCl、0.05%的K2HPO4 0.1%的NaH2PO4和0.01%的CaCl26H2O.49.50图2-2 RX-17溶菌酶的最适作用温度01002003004005000102030405060708090100t()酶活(u/mL)图2-3 RX-17溶菌酶的热稳定性0100200300400500010 2030 4050 6070 8090 100t()酶活(u/mL).51离子强度(mol/L)0 0.001 0.002 0.005 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5酶活力(U/mL)388 405 418 443 385 313 288 146 42 24.

7、52图2-4 RX-17溶菌酶的最适p H-广 泛范围p H 缓冲液-G l y-HCl 缓冲 液-Gly-NaOH缓 冲液01002003004005006002345678910 11pH酶活(u/mL)图2-5 RX-17溶菌酶的p H 稳定性1001502002503003504004505000123456789 10 11 12pH酶活(u/mL).53金属离子 金属离子(1mmol/L)相对酶活力(%)(1mmol/L)相对酶活力(%)None 100 CuCl2 0EDTA 30.0 CoCl2 28.8LiCl 92.5 BaCl2 106NaCl 95.3 FeSO4 0K

8、Cl 93.4 ZnSO4 0MgCl2 84.8 CdSO4 0CaCl2 104 AgNO3 26.0ZnCl2 0 Pb(CH3COO)2 0MnCl2 48.5.54.55020040060080010001200020406080100120t/min图2-6 RX-17溶菌酶对两种微球菌的溶菌曲线 -溶 壁微球菌A S 1.2 6 7O.D580图2-7 RX-17溶菌酶对葡萄球菌、八叠球菌的溶菌曲线 -金 黄色葡萄球菌A S 1.2 8 2-藤 黄八叠球菌A S 1.1 9 3020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.56图2

9、-8 RX-17溶菌酶对三种链球的溶菌曲线-嗜 酸链球菌 -粪 链球菌A S 1.1 01 -乳 脂链球菌A S 1.9020040060080010001200020406080100120t/minO.D580图2-9 RX-17溶菌酶对芽孢杆菌的溶菌曲线-枯 草芽孢杆菌A S 1.3 3 8-枯 草芽孢杆菌A S 1.8 8-球 形芽孢杆菌A S 1.9 3 0-短小芽孢杆菌AS1.940020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.57图2-10 RX-17溶 菌酶对乳杆菌的溶菌曲线 -保 加利亚乳杆菌A S 1.1 4 8 2-短 乳

10、杆菌 A S 1.12020040060080010001200020406080100120t/minO.D580图2-11 RX-17对酵母的溶菌曲线-酿 酒酵母A S 2.2 95 -热 带假丝酵母A S 2.1 0 0 1020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.58图2-12 RX-17溶菌酶对大肠杆菌的溶菌曲线 -大 肠杆菌A S 1.1 128-大 肠杆菌A S 1.7 7020040060080010001200020406080100120t/minO.D580图2-13 RX-17溶菌酶对其他细菌的溶菌曲线-产 氨短杆菌

11、A S 1.9 2 5 -铜 绿假单胞菌A S 1.1 1 2 9-粪 产碱杆菌A S 1.9 2 4020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.59.60粗酶液25-70%硫酸铵分级沉淀透析脱盐 各组分粗制品的制备:CM-Sephadex-C50 柱层析 00.6M NaCl 梯度洗脱 组分一粗品 PEG6000 浓缩,透析 组分二粗品 PEG6000 浓缩,透析 组分三粗品 80%硫胺沉淀浓缩,透析 CM-Sepharose FF 柱层析 CM-Sepharose FF 柱层析 DEAE-Sepharose FF 柱层析 Sephadex

12、-G75 柱层析 SDS-PAGE 电泳检测组分二纯度 SDS-PAGE 电泳检测组分一纯度 .61图3-1 RX-17溶菌酶各粗组分的分离-C M-S e p h a d ex-C50柱 层 析01020304050607080020406080100Fraction number(3mL/tube)O.D2800500100015002000250030003500400045005000Enzyme activity(U/mL)O.D280酶活力(U/mL).62图3-2 组分一的分离-C M-S e pharose Fast Flow柱 层 析010203040500102030405

13、0607080Fraction number(3mL/tube)O.D280010002000300040005000Enzyme activity(U/mL)O.D280酶活力(U/ml)图3-3 组分一的分离-S e p h a dex-G-75柱 层 析051015202530354045500102030405060708090100Fraction number(3mL/tube)O.D28005001000150020002500300035004000Enzyme activity(U/mL)O.D280酶活力(U/mL).63图3-6 组分二的分离-C M-S e pharos

14、e Fast Flow柱 层 析01020304050020406080100Fraction number(3mL/tube)O.D2800200040006000800010000Enzymeactivity(U/mL)O.D280酶活力(U/mL)图3-7 组分三的分离-D E A E-Sepharose Fast Flow柱 层 析01020304050010203040506070Fraction number(3mL/tube)O.D28001002003004005006007008009001000Enzyme activity(U/mL)O.D280酶活力(U/mL).64.

15、65R1组分R2组分分子量等电点最适温度热稳定性最适作用离子强度最适作用pHpH耐受性16,8009.17060 1h残存20.3%06.66.0-9.024,8009.75560 1h残存15.7%07.09.0-11.0.66.67.68020040060080010001200020406080100120t/min 图3-16 组分一对两种微球菌的溶菌曲线 -溶 壁微球菌A S 1.2 6 7O.D580020040060080010001200020406080100120t/min图3-17 组分二对两种微球菌的溶菌曲线 -溶 壁微球菌A S 1.2 6 7O.D580.69图3-

16、18 组分一对葡萄球菌、八叠球菌的溶菌曲线 -金 黄色葡萄球菌A S 1.2 8 2-藤 黄八叠球菌A S 1.1 9 3020040060080010001200020406080100120t/minO.D580图3-19 组分二对葡萄球菌、八叠球菌的溶菌曲线 -金 黄色葡萄球菌A S 1.2 8 2-藤 黄八叠球菌A S 1.1 9 3020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.70图3-26 组分一对大肠杆菌的溶菌曲线 -大 肠杆菌A S 1.1 128-大 肠杆菌A S 1.7 702004006008001000120002040

17、6080100120t/minO.D580图3-27 组 分二对大肠杆菌的溶菌曲线 -大 肠杆菌A S 1.1 128-大 肠杆菌A S 1.7 7020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.71图3-28 组分一对其他细菌的溶菌曲线-产 氨短杆菌A S 1.9 2 5 -铜 绿假单胞菌A S 1.1 1 2 9-粪 产碱杆菌A S 1.9 2 4020040060080010001200020406080100120t/minO.D580图3-29 组分二对其他细菌的溶菌曲线-产 氨短杆菌A S 1.9 2 5 -铜 绿假单胞菌A S 1.

18、1 1 2 9-粪 产碱杆菌A S 1.9 2 4020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.72图3-30 组分一对酵母的溶菌曲线-酿 酒酵母A S 2.2 95 -热 带假丝酵母A S 2.1 0 0 1020040060080010001200020406080100120t/minO.D580图3-31 组分二对酵母的溶菌曲线-酿 酒酵母A S 2.2 95 -热 带假丝酵母A S 2.1 0 0 1020040060080010001200020406080100120t/minO.D580.73图4-1 牙 膏加量对R X-1 7

19、 溶菌 酶 活 力 的 影响010203040506070809010003691215牙膏加量(g)相对酶活力(%)牙膏浸出液所占体积比（%）0 1 2 4 10 20 40 100酶活力（U/mL）283 197 82 14 4 2 0 0相对酶活（%）100 69.6 29.0 4.94 1.41 0.71 0 0.74.75牙膏组成成分常用成分对 RX-17 溶菌酶的抑制情况摩擦剂表面活性剂和泡沫剂保湿剂增稠剂粘合剂氟化物等固形物SDS甘油CMCCMCNaF -+-+-.76 Triton X-100对含有SDS的RX-17溶菌酶活力的影响Triton X-100加量（%）对照 0 0

20、.01 0.05 0.1 0.5 1 5 10酶活力（U/mL）348 12.3 294 336 442 480 470 494 522相对酶活（%）100 3.54 84.5 96.7 127 138 135 142 150.7740条件下过滤除菌酶液与未除菌酶液酶活变化情况保存天数 0 1 3 5 10 15 20除菌组相对酶活（%）100 96.1 87.5 80.4 59.6 45.6 42.0未除菌组相对酶活（%）100 76.6 65.3 41.5 18.1 0 0.78加入各种试剂后各样品 60、70保温 1h 残存酶活样品 对照 0.1%0.1%1%10%3%0.5%0.5%1

21、%5%BSA Triton Triton 甘油 NaCl 甲苯 Tween 甘氨酸 乙醇60 23.6 27.1 44.9 35.0 17.1 45.1 24.6 28.7 30.8 22.670 7.34 9.76 4.31 5.13 17.3 42.7 10.2 7.66 11.5 4.25加入各种试剂后各样品 40保存 30 d 的残存酶活样品 对照 0.1%0.1%1%10%3%0.5%0.5%1%5%BSA Triton Triton 甘油 NaCl 甲苯 Tween 甘氨酸 乙醇 7d 35.6 35.1 82.2 58.3 80.9 67.5 34.2 66.1 43.6 41.

22、4 15d 10.4 18.6 38.1 25.4 65.7 60.8 16.7 27.5 21.5 16.7 30d 5.6 7.7 10.4 6.7 54.4 50.4 6.7 5.3 7.8 4.4.79.80.81.82.83.84.85.86.87.88.89.90.91.92.93.94.95.96.97PCR验证.98.99.100.101.102.103 R2.104 M1.105/-折叠桶 6个-螺旋和8个-折叠 Asp-9、Asp-98及Glu-100.106.107.108.109PCR验证.110EcoRI HindIII 双酶切验证.111IPTG终浓度1mmol/L 诱导时间：2h.112.113.114最适作用温度.115热稳定性.1160102030405060708090100234567891011pH相对酶活力(%)最适作用pH.117pH稳定性.118