蛋白质化学1-课件.ppt

1、第第 三三 章章蛋白质化学蛋白质化学 Chemistry of Protein第一节第一节通通 论论一、一、蛋白质的化学概念蛋白质的化学概念 蛋白质（蛋白质（protein）是由许多是由许多氨基酸氨基酸（amino acids）通过通过肽键（肽键（peptide bond）相相连形成的有特定空间结构和生物学活性的高分连形成的有特定空间结构和生物学活性的高分子含氮化合物。子含氮化合物。二、二、蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物蛋白质是生物 体重要组成成分体重要组成成分分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。细胞的各

2、个部分都含有蛋白质。含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的分子，占人体干重的45，某些组织含量更，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。2.蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能 作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）代谢调节作用（胰岛素）代谢调节作用（胰岛素）免疫保护作用（抗体）免疫保护作用（抗体）物质的转运和存储（血红蛋白、乳物质的转运和存储（血红蛋白、乳-酪蛋白）酪蛋白）运动与支持作用（肌动蛋白、微管蛋白接头蛋白运动与支持作用（肌动蛋白、微管蛋白接头蛋白）参与细胞间信息传递（膜受体蛋白）

3、参与细胞间信息传递（膜受体蛋白）3.氧化供能氧化供能*根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质（单纯蛋白质（Simple Protein）结合蛋白质（结合蛋白质（Conjugate Protein）=蛋白质部分蛋白质部分 +非蛋白质部分非蛋白质部分 *根据蛋白质形状根据蛋白质形状 纤维状蛋白质（纤维状蛋白质（Fibrouse Protein）：）：难难溶于水，结构蛋白溶于水，结构蛋白 球状蛋白质（球状蛋白质（Globular Protein）：）：多溶于水，功能蛋白多溶于水，功能蛋白 三、三、蛋白质的分类蛋白质的分类 *根据蛋白质功能根据蛋白质功能 /溶解度溶解度 纤维状蛋白质和球状蛋

4、白质纤维状蛋白质和球状蛋白质四、四、蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 主要有主要有C、H、O、N，还有，还有S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘还含有碘。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。可通过测定含氮量来计算蛋白质可通过测定含氮量来计算蛋白质：蛋白质含量蛋白质含量=蛋白氮蛋白氮 6.251/16%蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点第二节第二节 蛋白质的组成单位蛋白质的组成单位 氨基酸氨基酸一、氨基酸一般结构特征一、氨基酸一般结构特征蛋白质在酸、碱或

5、酶的作用下，水解为氨基酸蛋白质在酸、碱或酶的作用下，水解为氨基酸（Amino AcidAmino Acid）蛋白质的基本结构单位。蛋白质的基本结构单位。存在自然界中的氨基酸有数百种，但组成生物存在自然界中的氨基酸有数百种，但组成生物体蛋白质的氨基酸（编码氨基酸）主要有体蛋白质的氨基酸（编码氨基酸）主要有20种。种。氨基酸结构通式（氨基酸结构通式（-氨基酸）氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH22个特殊氨基酸个特殊氨基酸脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸氨基酸的构型氨基酸的构型 组成蛋白质的氨组成蛋白质的氨基

6、酸除基酸除Gly（R=H）以外都有以外都有手性碳原子手性碳原子，在三维空间上就有两在三维空间上就有两种不同的排列方式，种不同的排列方式，它们互为镜影，这两它们互为镜影，这两种不同的构型分别称种不同的构型分别称为为D-型型和和L-型型。二、氨基酸的分类和结构二、氨基酸的分类和结构酸碱性：中性、酸性、碱性酸碱性：中性、酸性、碱性R基结构：脂肪、芳香、杂环基结构：脂肪、芳香、杂环R基物理性质基物理性质：疏水、亲水：疏水、亲水R基结构：基结构：依依R基团结构分类基团结构分类非极性氨基酸（非极性氨基酸（Nonpolar Amino Acids）9种种极性，不带电荷氨基（极性，不带电荷氨基（Polar,U

7、ncharged Amino Acids）6/7种种 酸性氨基酸酸性氨基酸(-)（Acidic Amino Acids）2种种碱性氨基酸碱性氨基酸(+)（Basic Amino Acids）3种种含非极性含非极性R基团的氨基酸基团的氨基酸（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）含极性不带电荷含极性不带电荷R基团的氨基酸基团的氨基酸含带负电荷（酸性）含带负电荷（酸性）R基团的氨基酸基团的氨基酸含带正电荷（碱性）含带正电荷（碱性）R基团的氨基酸基团的氨基酸三、蛋白质三、蛋白质中修饰性氨中修饰性氨基酸基酸 四、非蛋白质氨基酸四、非蛋白质氨基酸五、氨基酸的一般性质五、氨基酸的一般性质u 无色晶体或粉末状无色晶体或粉末

8、状 u 熔点高：熔点高：200 Cu 紫外吸收性质：芳香、杂环氨基酸紫外吸收性质：芳香、杂环氨基酸u 旋光性：旋光性：Gly除外除外u 溶解性：一般溶于水、稀酸碱；不溶于溶解性：一般溶于水、稀酸碱；不溶于 有机溶剂有机溶剂色氨酸色氨酸：280 nm 酪氨酸：酪氨酸：278 nm 苯丙氨酸：苯丙氨酸：259 nm紫外吸收紫外吸收大多数蛋白质含有大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶所以测定蛋白质溶液液280nm的光吸收的光吸收值是分析溶液中蛋值是分析溶液中蛋白质含量的快速简白质含量的快速简便的方法。便的方法。旋光性旋光性 组成蛋白质的氨基酸除组成蛋白质的氨基酸除Gl

9、y以外，都有手性碳以外，都有手性碳原子，原子，所以都有旋光性，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转左或向右旋转，向左旋转的称，向左旋转的称左旋左旋，用，用“一一”号表号表示，向右旋转的称示，向右旋转的称右旋右旋，用，用“”号表示。号表示。旋光物质旋光物质H2NCHCOOHCCH3OHHHCNH2COOHCCH3HHOL-（-）-苏氨酸苏氨酸D-（+）-苏氨酸苏氨酸六、氨基酸的化学性质六、氨基酸的化学性质结构结构 性质性质-氨基氨基，-羧基羧基 共性共性R基团基团 特性特性1.两性性质和等电点两性性质和等电点氨基酸为两性离子（兼性离子、偶极离子）氨基酸为两性离

10、子（兼性离子、偶极离子）两性离子两性离子(dipolar ion)H2NCHCOOHRH3NCHCOOR-+氨基酸在晶体或在水中主要以兼性离子形式存在氨基酸在晶体或在水中主要以兼性离子形式存在氨基酸是两性电解质氨基酸是两性电解质H2NCHCOORH3NCHCOOR-+-+H+H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+酸（供氢体）酸（供氢体）碱（受氢体）碱（受氢体）氨基酸的等电点（氨基酸的等电点（isoelectric point，pI）在一定的在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带的正电条件下，氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此

11、时溶液的pH称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点(isoelectric point,pI)。氨基氨基酸在等电点时溶解度最小。酸在等电点时溶解度最小。H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-正离子正离子pHpI+OH-+H+OH-+H+CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、离子形式存在，但也有少

12、量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。负离子形式，还有极少量的中性分子。氨基酸等电点决定于可解离基团氨基酸等电点决定于可解离基团氨基酸等电点的计算氨基酸等电点的计算解离常数：解离常数：pK值值H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H+OH-H2NCHCOOR-pK1 pK2 K1=A H+A+K2=A-H+A完全质子化完全质子化多元酸多元酸Henderson-Hasselbalch方程：方程：pH=pKa+lg 质子受体质子受体 质子供体质子供体 pK值值：指某种解离基团有一半被解离时的：指某种解离基团有一半被解离时的pH值。值。AA-A+甘氨酸酸甘氨酸酸碱滴

13、定曲线碱滴定曲线pK1pK22.349.60Gly等电点的计算等电点的计算H3NCH2COOHH3NCH2COO-+H2NCH2COO-Gly+Gly+-Gly-H+K1H+K2K1=Gly H+Gly+K2=Gly-H+GlypI时，时，Gly+=Gly-则：则：=Gly H+K1Gly K2H+H+2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI =（2.34+9.60）/2=5.97Gly谷氨酸酸碱滴定曲线谷氨酸酸碱滴定曲线pK2pK1pK3Glu等电点的计算等电点的计算pK1pK2pK32.199.674.24pI=（pK1+pK2）/2=(2.19+4.25)

14、=3.22赖氨酸酸碱滴定曲线赖氨酸酸碱滴定曲线pK2pK1pK3Lys等电点的计算等电点的计算pK2pK1pK32.1810.538.95pI=（pK2+pK3）/2=(8.95+10.53)=9.742.氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应u茚三酮反应茚三酮反应u亚硝酸反应亚硝酸反应u甲醛的反应甲醛的反应u2.4二硝基氟苯反应（二硝基氟苯反应（FDNB）u与苯异硫氰酸（酯）的反应与苯异硫氰酸（酯）的反应u二甲基氨基萘磺酰氯反应（二甲基氨基萘磺酰氯反应（DNS-Cl）u氨基酸与酰化剂（苄氧羰酰氯）的反应氨基酸与酰化剂（苄氧羰酰氯）的反应u成盐和成酯反应成盐和成酯反应 茚三酮反应茚三酮反应 氨基酸与

15、茚三酮氨基酸与茚三酮水合物弱酸条件下共水合物弱酸条件下共热，可生成热，可生成蓝紫色蓝紫色化化合物，其最大吸收峰合物，其最大吸收峰在在570nm处。由于此处。由于此吸收峰值与氨基酸的吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定因此可作为氨基酸定量分析方法。量分析方法。Pro黄色（黄色（440nm）氨、胺不放氨、胺不放CO2亚硝酸反应亚硝酸反应RCHCOOHNH2+HNO2RCHCOOHOH+H2O +N2 氨基酸氨基酸羟酸羟酸用途：氨基酸定量；蛋白质水解程度测定用途：氨基酸定量；蛋白质水解程度测定甲醛滴定甲醛滴定H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H+OH-+H

16、+OH-H2NCHCOOR-甲醛反应甲醛反应 一羟甲基衍生物一羟甲基衍生物二羟甲基衍生物二羟甲基衍生物pH=pK+logH2NCH2COO-H3+NCH2COO-+OH-弱酸弱酸2.4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（FDNB/DNFB）反应（）反应（Sanger）HNHCCOOHR+F-O2NNO2H2NHCCOOHR+FO2NNO2在弱碱中 室室 温温 pH 8-9FDNBDNP-氨基酸（黄色）氨基酸（黄色）苯异硫氰酸（苯异硫氰酸（PITC，Edman反应）反应）H2NCCOOHR+在弱碱中NCSHNCNCCHHOOHRHSH+NCNCCOHRHSPITCPTC-氨基酸氨基酸PTH-氨基酸氨基酸P

17、TC：苯氨基硫甲酰；：苯氨基硫甲酰；PTH：苯乙内酰硫脲：苯乙内酰硫脲5-二甲氨基萘二甲氨基萘-1-磺酰氯磺酰氯(DNS-Cl)反应反应用途：用途：N端氨基酸标记；微量氨基酸定量端氨基酸标记；微量氨基酸定量H2NHCCOOHRNH3CCH3SOOCl+NH3CCH3SOOHNHCCOOHR+HClDNS-ClDNS-氨基酸荧光荧光酰基化反应酰基化反应+CH2OCOClH2NCHCOONaR在弱碱中（后酸化）CH2OCONCHCOOHRH+Na+Cl-苄氧羰酰氯苄氧羰酰氯苄氧羰酰苄氧羰酰-氨基酸氨基酸用途：蛋白质人工合成中氨基保护剂用途：蛋白质人工合成中氨基保护剂成盐和成酯反应成盐和成酯反应H2

18、NCCOOHRH+NaOH+C2H5OH干燥H2NCCOONa +H2ORHH2NCCOOC2H5 +H2ORHHClHCl七、氨基酸的分离和分析鉴定氨基酸的分离和分析鉴定蛋白质的水解蛋白质的水解氨基酸混合物氨基酸混合物u 酸水解：酸水解：6 mol/L HCl,110 120?5C,24 hu 碱水解：碱水解：5 mol/L NaOH 110?5C,24 hu 酶水解：（酶水解：（部分水解）部分水解）氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定u 纸层析纸层析 u 薄层层析薄层层析u 离子交换柱层析离子交换柱层析 纸层析纸层析(paper chromatography)纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层

19、析。纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用速度用Rf值表示：（物质结构、溶剂系统的物质值表示：（物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响组成等因素都会影响Rf值）值）Rf 原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的

20、距离原点原点前沿前沿双向纸层析双向纸层析薄层层析（薄层层析（thin-layer chromatography）以硅胶、氧化铝、纤以硅胶、氧化铝、纤维素粉等为支持剂维素粉等为支持剂 支持剂涂布于玻璃板支持剂涂布于玻璃板上上均匀薄层均匀薄层 样品滴加在薄层一端样品滴加在薄层一端离子交换柱层析（离子交换柱层析（ion-exchange column chromatography）以离子交换树脂作为支持物，离子交换树以离子交换树脂作为支持物，离子交换树脂上的活性基团可与溶液中的离子（氨基酸）脂上的活性基团可与溶液中的离子（氨基酸）进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，进行交换反应，由于各种离子交换

21、能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。目的。离子交换树脂：离子交换树脂：人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物有网状结构的高分子聚合物阳离子交换树脂阳离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂AA2.975.689.74第三节第三节 蛋白质的结构蛋白质的结构自然界存在的蛋白质自然界存在的蛋白质1010-1012组成蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸20种种20世纪世纪50年代初，年代初，Linder

22、stron-Long：蛋白质：蛋白质具有不同结构层次具有不同结构层次 一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级高级结构结构蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括:一、一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(primary structure)定义定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序和连接方式。的排列顺序和连接方式。主要的化学键主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫

23、键。肽键，有些蛋白质还包括二硫键。(Peptide bond,Disulfide bond)(Peptide bond,Disulfide bond)1.肽键和肽链肽键和肽链肽键肽键(peptide bond):一个氨基酸的一个氨基酸的-羧基羧基与另一个氨基酸的与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而氨基脱水缩合而形成的共价键，又称酰胺键形成的共价键，又称酰胺键。NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO肽键

24、的形成肽键的形成-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3+胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3 二硫键的形成二硫键的形成半胱氨酸半胱氨酸肽和多肽链肽和多肽链*肽肽：氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。：氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨，三分子氨 基酸缩合则形成基酸缩合则形成三肽三肽*由少于由少于1010个

25、氨基酸相连而成的肽称为个氨基酸相连而成的肽称为寡寡 肽肽 (oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形，由更多的氨基酸相连形 成的肽称成的肽称多肽多肽(polypeptide)。*多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸是指许多氨基酸 之间以肽键连接而成的一种结构。之间以肽键连接而成的一种结构。多肽链的特点多肽链的特点*氨基酸残基氨基酸残基(residue)：肽链中的氨基酸分子肽链中的氨基酸分子 因为脱水缩合而基团不全。因为脱水缩合而基团不全。*多肽链有两端多肽链有两端:(Amino,Carboxyl terminal)(Amino,Carboxyl termin

26、al)N 末端：多肽链中有自由氨基的一端末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端末端：多肽链中有自由羧基的一端*结构骨干结构骨干(Backbone)(Backbone)由由-N-C-C-重复排列重复排列 N：酰胺氮酰胺氮，C：手性碳原子，手性碳原子，C：羰基碳羰基碳 H2NCHCR1OHNCHCR2OHNCHCR3OHNCHCOHRnO 一级结构一级结构的的含义、特点和意义含义、特点和意义 含义：含义：氨基酸种类：氨基酸种类：20氨基酸数目：总数，每种氨基酸数氨基酸数目：总数，每种氨基酸数目目氨基酸连接次序氨基酸连接次序特点：特点：方向性方向性 多样性多样性意义意义：

27、生物学功能的基础生物学功能的基础 空间结构的基础空间结构的基础 2.2.几种生物活性肽几种生物活性肽 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽多肽抗菌素多肽抗菌素 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 神经肽神经肽(neuropeptide)脑啡肽脑啡肽（高等动物脑组织）：内源性吗啡（高等动物脑组织）：内源性吗啡样活性物质，镇痛样活性物质，镇痛蛋氨酸脑啡肽：蛋氨酸脑啡肽：HTyr-Gly-Gly-Phe-MetOH亮氨酸脑啡肽：亮氨酸脑啡肽：HTyr-Gly-Gly-Phe-LeuOH含脑啡肽的神经元与疼痛含脑啡

28、肽的神经元与疼痛 SP：P物质物质-神经末梢释放兴奋递质神经末梢释放兴奋递质E:脑啡肽脑啡肽-与阿片受体结合，减少感觉神与阿片受体结合，减少感觉神经末梢释放经末梢释放P物质物质3.肽链的表示方式肽链的表示方式N 端端C 端端胰岛素（胰岛素（Insulin）4.一级结构的测定一级结构的测定意义：意义：阐明蛋白质活性中心阐明蛋白质活性中心 了解结构与功能的关系了解结构与功能的关系 说明分子进化、遗传与变异等现象说明分子进化、遗传与变异等现象 了解分子病发病机制了解分子病发病机制人工合成蛋白质人工合成蛋白质测定步骤测定步骤 纯化蛋白质样品纯化蛋白质样品 测定蛋白质的分子量和氨基酸组成测定蛋白质的分子

29、量和氨基酸组成 氨基酸末端分析（氨基酸末端分析（N-端、端、C-端端）肽链的拆分肽链的拆分 肽链的部分水解肽链的部分水解分离纯化各肽段并采用分离纯化各肽段并采用Edman(PITC)降解法测序降解法测序用重叠法推断肽链全部氨基酸序列用重叠法推断肽链全部氨基酸序列二硫键的定位二硫键的定位氨基酸末端分析氨基酸末端分析N端分析方法端分析方法 24-二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（FDNB）苯异硫氰酸法（苯异硫氰酸法（PITC）二甲基氨基萘磺酰氯（二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）C端分析方法端分析方法 肼解法肼解法 羧肽酶法羧肽酶法24-二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（FDNB）Sanger pH 8-96

30、mol/L HClDNP肽肽乙酸乙酯抽提后只有乙酸乙酯抽提后只有DNP-氨基酸留在有机相氨基酸留在有机相DNP-氨基酸（黄色）氨基酸（黄色）苯异硫氰酸法（苯异硫氰酸法（PITC）/Edman降解法降解法 加热加热二甲基氨基萘磺酰氯（二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）肼解法肼解法羧肽酶法羧肽酶法 羧肽酶羧肽酶（carboxypeptidase）：作用于肽链的）：作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸。游离羧基末端释放单个氨基酸。羧肽酶羧肽酶 A:除除 Lys,Arg,Pro，Pro(-2)羧肽酶羧肽酶B：水解水解 Arg,Lys,非非(Pro -2)肽链的拆分肽链的拆分u 非共价键：变性剂非共价

31、键：变性剂u 共价键：二硫键共价键：二硫键 过甲酸氧化法过甲酸氧化法 还原法还原法肽链的部分水解肽链的部分水解u 化学法：溴化氰（化学法：溴化氰（CNBr）法）法u 酶法：胰蛋白酶酶法：胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶胃蛋白酶 溴化氰（溴化氰（CNBr）裂解法）裂解法肽酰高丝酸内酯肽酰高丝酸内酯专一水解甲硫氨酸羧基形成的肽键专一水解甲硫氨酸羧基形成的肽键胰蛋白酶胰蛋白酶Trypsin Lys-ProArg-Pro 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶/糜蛋白酶（糜蛋白酶（chymotrypsin）：芳香族氨基酸的羧基端芳香族氨基酸的羧基端 (Phe，Tyr，Trp，不于不于Pro相连相连)胃蛋白酶（胃蛋白酶（pepsin）：）：断裂键的两端均为疏水断裂键的两端均为疏水氨基酸氨基酸(Leu-Val)胰蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶/糜蛋白酶糜蛋白酶嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶内肽酶内肽酶片段重叠法片段重叠法 N-A-B-C-D-E-F-G-H-M-N-C 酶酶1 A-B-C-D E-F-G H-M-N酶酶2 A-B-C D-E-F G-H-M-N二硫键的定位二硫键的定位 对角线电泳对角线电泳 过甲酸过甲酸