第二章各种工具酶课件.ppt

1、第二章各种工具酶第二章各种工具酶内容提要内容提要n第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 n第二节第二节 DNA 连接酶连接酶 n第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶 (聚合酶聚合酶 I/Taq聚合酶聚合酶 /反转录酶反转录酶)第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 Restriction endonuclease（RE）n一、限制性核酸内切酶的概念一、限制性核酸内切酶的概念n二、限制性内切酶的命名二、限制性内切酶的命名n三、限制性内切酶的类型三、限制性内切酶的类型n四、影响限制性酶活性的因素四、影响限制性酶活性的因素n五、限制性内切酶对五、限制性内切酶对DNA的消化的消化一、概念

2、一、概念1.定义定义n是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNA中的特定核苷中的特定核苷酸序列，并在特定位点切割双链酸序列，并在特定位点切割双链DNA的的内切酶。内切酶。2.来源来源n细菌细菌的限制性内切酶。的限制性内切酶。3.功能功能(1)限制限制 Restrictionn侵入细菌体内的外源侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，从而保能被限制性内切酶识别和降解，从而保护自身的护自身的DNA不被降解。不被降解。图图 细菌的限制系统细菌的限制系统n细菌自身的细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。而防止限制

3、性内切酶的识别和水解。Dam甲基化酶甲基化酶n在在GATC序列的序列的腺嘌呤腺嘌呤N6位引入甲基。位引入甲基。Dcm甲基化酶甲基化酶n在在CCAGG序列的第序列的第2个个胞嘧啶胞嘧啶C5位引入位引入甲基。甲基。(2)修饰修饰 Modification图图 细菌的修饰系统细菌的修饰系统图图 甲基化位点：甲基化位点：DNA上的上的 A/C二、限制性内切酶的命名二、限制性内切酶的命名n1973年年Smith等提出酶的命名原则。等提出酶的命名原则。n用用属名属名的第一个字母和的第一个字母和种名种名的头两个字的头两个字母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌（Escheric

4、hia coli）用）用Eco表示。用一个表示。用一个大写字母表示菌株或型。如大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一。同一宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马字母表示。如字母表示。如EcoR I。限制酶的命名限制酶的命名图图 几种重要的限制酶几种重要的限制酶图图 几种限制酶的识别位点几种限制酶的识别位点三、限制性内切酶的分类三、限制性内切酶的分类n分为分为I 型、型、II型和型和III型。型。1.I 型限制性内切酶型限制性内切酶n1968年，首先由年，首先由M.Meselson和和R.Yuan在大肠杆菌在大肠杆菌 B株和株和 K株分离。如株分离。如 EcoB和和

5、 EcoK。（1）识别序列）识别序列n未甲基化修饰的特异序列：未甲基化修饰的特异序列：EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位点）切割位点n切点距离识别位点约切点距离识别位点约4007000 bp。不在。不在识别位点。随机切开一条单链。识别位点。随机切开一条单链。n如一条如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶链甲基化，就行使甲基化酶功能，使另一条链甲基化。功能，使另一条链甲基化。n如两条链已甲基化，酶从如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。链解离。n需需ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸。腺苷甲硫氨酸。2.III 型限制性内切酶型限制性内切酶n与与I型酶有甲

6、基化功能。型酶有甲基化功能。n能在能在DNA链上的特异位点切割。链上的特异位点切割。n其切割位点在识别位点以外。其切割位点在识别位点以外。n反应需要反应需要ATP、Mg2+和和S-腺苷蛋氨酸。腺苷蛋氨酸。n基因工程中用途不大。基因工程中用途不大。n如如EcoP15:CAGCAG-3.II型限制性内切酶型限制性内切酶n1970年，年，H.O.Smith和和K.W.Wilcox首先首先从流感嗜血菌中分离出从流感嗜血菌中分离出Hind。（1）识别序列与特点）识别序列与特点n双链双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。未甲基化修饰的靶序列。n识别序列长度识别序列长度4 8 bp。n多数是回文结构。多数是回文

7、结构。II s型除外。型除外。（2）酶切位点）酶切位点n在识别位点处，切开双链在识别位点处，切开双链DNA，形成粘，形成粘性末端或平齐末端。性末端或平齐末端。图图 类酶识别序列特点：回文序列类酶识别序列特点：回文序列(3)平齐末端平齐末端 blunt endnEcoR V：产生平齐末端。：产生平齐末端。n5-GATATC-3 n3-CTATAG-5 (4)粘性末端粘性末端 sticky endn含有几个核苷酸的单链末端。含有几个核苷酸的单链末端。5 端突出端突出EcoR I：形成形成5-粘性末端。粘性末端。n5-GAATTC-3 n3-CTTAAG-5 3 端突出端突出Pst I：形成形成3-

8、粘性末端。粘性末端。n5-CTGCAG-3 n3-GACGTC-5GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 EcoR I：5端凸出端凸出CTGCAG GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC Pst I：3端凸出端凸出粘性末端的意义粘性末端的意义连接方便连接方便n不同的不同的DNA双链：双链：只要粘性末端碱基互只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。容易的多。n同一个同一个DNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

9、的粘性末端可以连接成环形分子。图图 粘性末端连接粘性末端连接5末端标记末端标记n凸出的凸出的5末端可用末端可用DNA多核苷酸激酶进多核苷酸激酶进行行32P标记。标记。n凸出的凸出的3端可以通过末端转移酶添加几端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）等）造成人工粘性末端。造成人工粘性末端。补平成平齐末端补平成平齐末端n粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐聚合酶补平成平齐末端。末端。四、同裂酶四、同裂酶 Isoschizomersn识别位点的序列相同的限制性内切酶。识别位点的序列相同的限制性内切酶。n 完全同裂酶完全同裂酶n识别序列相

10、同和切点相同。识别序列相同和切点相同。Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 n 不完全同裂酶不完全同裂酶n识别序列相同，但切点不同。识别序列相同，但切点不同。五、同尾酶五、同尾酶 Isocaudamers1.定义定义n识别序列不同，但能切出相同的粘性末识别序列不同，但能切出相同的粘性末端。端。n如如BamH I、Bgl、Bcl I等为同尾酶。等为同尾酶。2.特点特点n同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的新位点，不能再被原来的酶所识别。新位点，不能再被原来的酶所识别。5-GGATCC-3 3

11、-CCTAGG-5 BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3A同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别六、限制酶的活性六、限制酶的活性n限制性内切酶的识别和酶切活性，只有限制性内切酶的识别和酶切活性，只有在最适条件下，才表现出最大酶切能力在最适条件下，才表现出最大酶切能力和位点专一性。和位点专一性。1.活性的定义活

12、性的定义n在适当反应条件下，在适当反应条件下，1小时内完全酶解小时内完全酶解1 g特定特定DNA底物，所需要的限制性内底物，所需要的限制性内切酶的量，为一个活性单位。切酶的量，为一个活性单位。星号活性星号活性:n改变反应条件，导致限制酶的专一性和改变反应条件，导致限制酶的专一性和切割效率的改变。切割效率的改变。n如如EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性活性。n使用时要防止星号活性。使用时要防止星号活性。2.星号活性（星号活性（*）在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等5-GAATTC-3EcoR I：七、三类限制酶的特

13、性比较七、三类限制酶的特性比较特性特性I类内切酶类内切酶II类内切酶类内切酶III类内切酶类内切酶限制和修饰限制和修饰作用的活性作用的活性单一多功能的酶单一多功能的酶 内切酶和甲内切酶和甲基化酶分开基化酶分开共同亚基的双共同亚基的双功能酶功能酶酶蛋白结构酶蛋白结构3种不同亚基种不同亚基同型二聚体同型二聚体2种不同亚基种不同亚基限制所需要限制所需要的辅助因子的辅助因子ATP、Mg2+和和SAMMg2+ATP、Mg2+和和SAM特异性位点特异性位点或识别序列或识别序列EcoB：TGA(N)8TGCT回文序列回文序列 EcoR I：GAATTCEcoP1:AGACC 八、影响限制性酶活性的因素八、影

14、响限制性酶活性的因素1.DNA的纯度的纯度 nDNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。采取措施：采取措施：n纯化纯化DNA n加大酶的用量加大酶的用量 n延长保温时间延长保温时间 n 扩大反应体积（扩大反应体积（20 l）2.DNA的甲基化程度的甲基化程度（1）大肠杆菌有）大肠杆菌有2种甲基化酶修饰质粒：种甲基化酶修饰质粒：ndam甲基化酶：修饰甲基化酶：修饰GATC中的中的A。ndcm甲基化酶：修饰甲基化酶：修饰CCA/TGG的的C。（2）基因工程中使用的是）基因工程中使用的是甲基化酶失活甲基化酶失活突

15、变的菌株突变的菌株。3.温度温度 Tmn不同的限制性内切酶不同的限制性内切酶，最适反应温度不最适反应温度不同。同。n大多数是大多数是37oC，少数要求，少数要求40-65oC。酶酶最适最适oC酶酶最适最适oC酶酶最适最适oCMae II Mae III50 55BstE II Taq I60 65Apa IMae I Sma I3045 254.缓冲液缓冲液 Buffern缓冲液是影响限制酶活性的重要因素。化学组缓冲液是影响限制酶活性的重要因素。化学组成：成：nMgCl2、NaCl/KCl：提供：提供Mg2+和离子强度。和离子强度。nTris-HCl：维持：维持pH。n二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（

16、DTT）：保持酶稳定性。）：保持酶稳定性。n牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSA）：有助于酶的稳定。）：有助于酶的稳定。n商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。九、限制性内切酶酶切图谱九、限制性内切酶酶切图谱nRestriction mapping1.限制酶对限制酶对DNA的酶切方法的酶切方法完全酶切完全酶切/消化消化n对对DNA上所有的识别位点都被酶切开。上所有的识别位点都被酶切开。应用有限。应用有限。部分酶切部分酶切/消化消化nDNA上只有部分酶切位点被切开。上只有部分酶切位点被切开。n部分酶切的方法：部分酶切的方法：缩短保温时间、降低缩短保温时间、降低反应

17、温度、减少酶的用量。反应温度、减少酶的用量。图图 完全酶切完全酶切n如如EcoR I（GAATTC）的）的 4个位点都被个位点都被切开。切开。12 341234图图 部分酶切部分酶切n4个个EcoR I位点中，仅酶切位点中，仅酶切2个位点。个位点。12 34142.限制性内切酶图谱限制性内切酶图谱（1）定义）定义nDNA上某些限制性内切酶酶切位点的图上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为谱，可作为DNA片段的特殊标记。也称片段的特殊标记。也称DNA物理图谱。物理图谱。（2）酶切图谱的建立）酶切图谱的建立n识别识别4个个核苷酸的内切酶，在核苷酸的内切酶，在DNA链上链上出现机率为：出现机率为：

18、1/441/256bpn识别识别6个个核苷酸的内切酶，在核苷酸的内切酶，在DNA链上链上出现机率为：出现机率为：1/46 1/4.1kbn识别识别8个个核苷酸的内切酶，在核苷酸的内切酶，在DNA链上链上出现机率为：出现机率为：1/481/65.5kb3.限制酶酶切图谱的分析限制酶酶切图谱的分析EcoR1NotIEcoRINotI2.0 kb3.0 kb1.0 kbEcoRINotIEcoRI/NotI3.0kb5.0 kb2.0 kb3.0 kb5.0 kb4.0 kb1.0 kb4.酶切产物的检测酶切产物的检测琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法nDNA经内切酶酶切，然后在琼脂糖凝胶经内切酶酶切

19、，然后在琼脂糖凝胶电泳分析。适合小分子电泳分析。适合小分子DNA分析。分析。Southern Blot法法nDNA酶切后，电泳分离。后变性后转移酶切后，电泳分离。后变性后转移到尼龙膜或硝酸纤维膜，然后与同位素到尼龙膜或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交，最后做放射自显影，标记的探针杂交，最后做放射自显影，检测多态性条带。检测多态性条带。琼脂糖凝胶电泳图谱琼脂糖凝胶电泳图谱第二节第二节 DNA 连接酶连接酶 ligase内容提要内容提要n一、一、DNA 连接酶的种类连接酶的种类 n二、二、DNA连接的特点连接的特点n三、连接反应的机理三、连接反应的机理n四、连接反应的温度四、连接反应的温度n

20、五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素一、一、DNA连接酶的种类连接酶的种类1.大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶n连接粘性末端。连接粘性末端。2.T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶n连接粘性末端。连接粘性末端。n连接齐平末端。连接齐平末端。二、连接反应的条件二、连接反应的条件n（1）必须是两条双链）必须是两条双链DNA。n（2）DNA3端有游离的端有游离的-OH，5端有一端有一个磷酸基团（个磷酸基团（P）。）。n（3）需要能量）需要能量n动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP n大肠杆菌中：大肠杆菌中：NAD+三、连接反应的机理三、连接反应的机理1.ATP（NAD+)提供激活的提供激活

21、的AMP。2.ATP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶-AMP”复合物，复合物，并释放出焦磷酸并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸与连接酶的赖氨酸-氨基相连。氨基相连。4.AMP随后从连接酶的赖氨随后从连接酶的赖氨酸酸-氨基转移到氨基转移到DNA一一条链的条链的5端端P上，形成上，形成“DNA-腺苷酸腺苷酸”复合物。复合物。5.3-OH对磷原子作亲核攻对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，击，形成磷酸二脂键，释放出释放出AMP。四、连接反应的温度四、连接反应的温度n1.最佳温度最佳温度n连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37 C。n2.实用温度实用温度n但在但在

22、37下粘性末端的结合很不稳定。下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用所以一般采用 416 C。五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素n1.插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 n1020倍。倍。n增加插入片段与载体的接触机会，减少增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。载体自我连接的现象。n2.反应温度反应温度n12.5。一般。一般1416。第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶内容提要内容提要n一、常用的一、常用的DNA聚合酶聚合酶n二、二、DNA聚合酶的特点聚合酶的特点n三、三、DNA聚合酶的用途聚合酶的用途一、常用的一、常用的DNA聚合酶聚合酶n1.大肠杆菌大肠

23、杆菌DNA聚合酶聚合酶 n2.Klenow fragment n3.T7 DNA聚合酶聚合酶 n4.T4 DNA聚合酶聚合酶 n5.修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 n6.逆转录酶逆转录酶二、二、DNA聚合酶的特点聚合酶的特点n1.共同特点共同特点n把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3-OH端。端。n2.主要区别主要区别n持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。nT7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。而不从模板上掉下来。n其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多多个个dNTPs就

24、会从模板上解离下来。就会从模板上解离下来。DNA聚合酶聚合酶35外切酶外切酶活性活性53外切外切酶活性酶活性聚合聚合速率速率持续持续能力能力大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低Klenow fragment低低无无中中低低T4DNA聚合酶聚合酶高高无无中中低低T7DNA聚合酶聚合酶高高无无快快高高化学修饰化学修饰T7DNA聚合酶聚合酶低低无无快快高高遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中Taq DNA聚合酶聚合酶无无有有快快高高3.DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较三、各种三、各种DNA聚合酶的用途聚合酶的用途n1.大肠杆菌大肠

25、杆菌DNA聚合酶聚合酶 In主要用来制备带放射性标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。（1）聚合酶）聚合酶I 的性质的性质n一条单链多肽。一条单链多肽。n具备具备53外切酶活性，位于外切酶活性，位于N端。端。n具备具备35外切酶活性。外切酶活性。n具备具备53的聚合酶活性的聚合酶活性。n用枯草杆菌蛋白酶处理，可以切掉用枯草杆菌蛋白酶处理，可以切掉N端的端的53外切酶活性部分，就成为外切酶活性部分，就成为Klenow fragment。（2）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制备探针制备探针n 核酸探针（核酸探针（probe）n能够同某种被研究的核酸序列特异性结能够同某种被研究的核酸序列特

26、异性结合的、带有标记的寡聚核苷酸。合的、带有标记的寡聚核苷酸。标记：标记：已知序列的核酸片段已知序列的核酸片段显示位置：显示位置：与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断 探针的标记方式探针的标记方式标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5 3 n DNA聚合酶聚合酶I 对探针序列的标记放射对探针序列的标记放射性同位素标记。性同位素标记。nA.放射性同位素标记放射性同位素标记n切口转移法切口转移法(nick translation)：n53外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的下一段切口

27、的下一段DNA的的5端除去一个核苷酸后，聚合酶端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段活性就会在切口的上一段DNA的的3一侧一侧补上一个新的核苷酸。补上一个新的核苷酸。切口转移法切口转移法切口切口切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 1.纯化的纯化的DNA片片段段2.DNase I 制造制造单链切口单链切口4.DNA Pol I 进进行切口转移行切口转移3.一种一种-32P-dNTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标记2.Klenow fragmentn（1）Klenow fr

28、agment的性质的性质nDNA Pol I经枯草杆菌蛋白酶经枯草杆菌蛋白酶酶切，酶切，失去失去53外切酶活性外切酶活性后后的大片段的大片段(76KD）。）。n具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性。性。（2）主要用途）主要用途n 3端补平端补平n补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。隐蔽端。5 5 klenowklenown DNA 3末端标记末端标记n在在3隐蔽端加上放射性标记的隐蔽端加上放射性标记的dNTP。3隐蔽末端的片段隐蔽末端的片段Klenow片段片段补平补平根据末端的顺序选择根据末端的顺序选择一种一种 -32P-dNTPs末端标记的末端

29、标记的DNA 限制性内切酶切限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1hmRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow fragment5 3 3 5 5 3 引物引物 cDNA第二链的合成第二链的合成3.T4 DNA聚合酶聚合酶n（1）T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质n 来源：从来源：从T4噬菌体感染后的大肠杆菌噬菌体感染后的大肠杆

30、菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编编码。码。n 酶活性：有酶活性：有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。外切酶活性（降解单链更快）。n 特点特点n当没有当没有dNTP时，时，T4DNA聚合酶行使聚合酶行使35外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出3隐蔽端。隐蔽端。n如果只有一种如果只有一种dNTP，则降解到该，则降解到该dNTP的位置。的位置。T4 DNA聚合酶聚合酶5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶聚合酶无无dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs5 5（2）T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途n 补平隐蔽末端补

31、平隐蔽末端n DNA 3末端标记末端标记n标记末端（取代合成法）方法：标记末端（取代合成法）方法：n用用35外切酶活性作用于所有末端形外切酶活性作用于所有末端形式的式的3端（平端、端（平端、3隐蔽端、隐蔽端、5隐蔽端）隐蔽端）制造出制造出3隐蔽端。隐蔽端。n再利用它的再利用它的53聚合酶活性补平，并聚合酶活性补平，并加入放射性标记的加入放射性标记的dNTP。酶切中间产生酶切中间产生两个末端标记两个末端标记加入某种加入某种32P-dNTP和和dNTPsT4 35外切酶外切酶DNA酶切片断酶切片断T4 53聚合酶聚合酶5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3

32、内切酶切内切酶切无无dNTPsa.放射性标记放射性标记n优点优点n制作简单、制作简单、高比放射性、高比放射性、放射自显影效放射自显影效果好。果好。n缺点缺点n半衰期短（半衰期短（32P只有只有14.3天）、不易保存、天）、不易保存、对人体有害、对人体有害、要求在专门实验室操作。要求在专门实验室操作。b.非放射性标记非放射性标记ni）生物素（）生物素（biotin）标记：）标记：n又称维生素又称维生素H。结构：。结构：nCH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOHn可以与可以与dNTP酰化结合成为生物素酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素、生物素-1,4-dATP、生物素

33、、生物素-1,1-dUTP等。等。n也可以被生物素连接酶（也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。催化与蛋白质共价结合。纯化的纯化的DNA片段片段DNaseI制造单链缺口制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移进行缺口转移生物素生物素-dTTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 生物素生物素-dTTP生物素生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中探针中光促生物素标记光促生物素标记生物素生物素连接臂连接臂光敏基因光敏基因探针序列探针序列探针序列探针序列生物素生物素连接臂连接臂光敏基因

34、光敏基因+光照光照ii）地高辛标记）地高辛标记n可以与可以与dNTP连接成地高辛连接成地高辛-dUTP等，参等，参入入DNA合成过程。形成地高辛标记的合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。探针。n地高辛的结合物是抗地高辛抗体。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。n生物素和地高辛标记的探针有试剂盒生物素和地高辛标记的探针有试剂盒(kit)。图图 试剂盒试剂盒(kit)iii）偶联酶及其底物）偶联酶及其底物n常用的两种酶：常用的两种酶：n辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRPO）n碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AP）n酶的作用

35、：酶的作用：n催化一些特殊的反应，反应的过程中发催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。出荧光（或生成有色的产物）。图图 化学发光底物化学发光底物图图 HRPO和和AP的显色反应底物的显色反应底物HRPO和和AP的显色反应底物的显色反应底物发光反应机理发光反应机理iv）用非放射性标记探针检测原）用非放射性标记探针检测原理理探针探针DNA用生物素或地高辛标记。用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。辛结合。图图 非

36、放射性标记探针检测原理非放射性标记探针检测原理*生物素生物素探针序列探针序列待测基因待测基因亲和素亲和素酶酶底物底物中间产物中间产物产物产物发光发光核酸探针杂交筛选法的缺点核酸探针杂交筛选法的缺点n只检测是否有外源只检测是否有外源DNA插入，而不论该插入，而不论该DNA是否表达出产物。是否表达出产物。4.T7 DNA聚合酶聚合酶n（1）来源）来源n从从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的。来的。n（2）结构）结构n由两个亚基组成：由两个亚基组成：n T7基因基因5编码的大亚基：有编码的大亚基：有53聚合聚合酶和酶和35外切酶活性。外切酶活性。n 大肠杆菌编码的小

37、亚基：硫氧还蛋白。大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。增加大亚基对模板的亲和性。（3）T7 DNA聚合酶的特点聚合酶的特点n 持续合成能力强持续合成能力强n一旦与模板结合就会不间断地合成互补一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。链。n 35外切酶活性高外切酶活性高n单链和双链都能降解。单链和双链都能降解。n 不受不受DNA二级结构的影响二级结构的影响n其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二级结构的阻碍二级结构的阻碍（3）T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途n 以大分子量以大分子量DNA为模板的合成，如为模板的合成，如M13。n 进行末端标记进行末端标记n取代合成法标记取

38、代合成法标记3末端。与末端。与T4 DNA聚合聚合酶相同。酶相同。n 补平隐蔽末端补平隐蔽末端n合成补平合成补平3隐蔽末端；水解修平隐蔽末端；水解修平3突出突出末端。末端。5.修饰后的修饰后的T7 DNA聚合酶聚合酶n（1）T7DNA聚合酶的化学修饰聚合酶的化学修饰n去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚合能聚合能力和聚合速率提高了力和聚合速率提高了3倍。倍。n（2）修饰后的）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途n DNA测序双脱氧法。测序双脱氧法。n 标记标记DNA 3隐蔽末端隐蔽末端n 更有效地补平末端更有效地补平末端6.反转录酶：反转录酶：AMVn依赖依赖RNA的的DN

39、A聚合酶（聚合酶（RNA指导的指导的DNA聚合酶）。聚合酶）。n（1）来源）来源nRNA肿瘤病毒。普遍使用的是来源于鸟肿瘤病毒。普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）。）。n（2）AMV的性质的性质n由由 和和 两条多肽链组成。两条多肽链组成。n 链链n有反转录活性和有反转录活性和 RNaseH活性活性nRNaseH：n 链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以以53或或35方向特异地水解方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNA链。链。n 链链nRNA-DNA杂交

40、双链中杂交双链中53DNA外切酶外切酶活性。活性。RNaseH RNaseHRNA DNARNA DNA（3）逆转录酶的用途）逆转录酶的用途n 合成合成cDNAn以以oligo dT为引物（与为引物（与mRNA的的polyA尾尾巴互补结合）。巴互补结合）。图图 cDNA合成合成nmRNAAAAAATTTTT5 3 5 cDNA 合成合成DNA探针探针n用随机引物或用随机引物或oligo dT做引物。做引物。n随机引物（随机引物（random primer）：随机顺：随机顺序形成的寡聚序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）与各种序列的模板结合）RT-PCR用的模板用的模板n克隆某个基因时，用其克隆某个基因时，用其mRNA反转录出反转录出cDNA第一链。第一链。