第七章、质粒课件.ppt

1、第七章、质第七章、质 粒粒一、质粒的命名一、质粒的命名二、质粒的遗传特性二、质粒的遗传特性三、质粒的分离、检测与纯化三、质粒的分离、检测与纯化四、质粒的复制和调节四、质粒的复制和调节五、质粒的稳定性五、质粒的稳定性v质粒（质粒（plasmid）大多是由大多是由DNA组成的环形分组成的环形分子，比宿主染色体小，在空间上与染色体隔子，比宿主染色体小，在空间上与染色体隔开，能够自我复制的遗传结构，通常具有共开，能够自我复制的遗传结构，通常具有共价、闭合、环状价、闭合、环状DNA的基本特征。的基本特征。v有些质粒即可以整合进宿主染色体又可以游有些质粒即可以整合进宿主染色体又可以游离在细胞质中，这类质粒

2、又称为附加体。离在细胞质中，这类质粒又称为附加体。一、质粒的命名一、质粒的命名v由由3个英文字母和编号组成。个英文字母和编号组成。v第第1个小写字母个小写字母“p”表示表示plasmid;后面的后面的2个大写字母表示发个大写字母表示发现者或构建人、构建实验室的名称；最后是编号。如：质粒现者或构建人、构建实验室的名称；最后是编号。如：质粒 pBR322 是由是由 Bolivar 和和 Rodrigres 2位墨西哥学者所构建。位墨西哥学者所构建。v质粒的命名不能离开宿主，一般将质粒写在宿主名称后面的质粒的命名不能离开宿主，一般将质粒写在宿主名称后面的括号中，每一个质粒占一个括号。如：括号中，每一

3、个质粒占一个括号。如：E.coli DH5(pBR 322)E.coli k12（F）二、质粒的遗传特性二、质粒的遗传特性 1、质粒的表型效应、质粒的表型效应v 质粒同染色体基因一样具有一定的表型效应。如：质粒同染色体基因一样具有一定的表型效应。如：F因子因子最明显的表型是编码细胞壁外的性纤毛（最明显的表型是编码细胞壁外的性纤毛（sex pili），使细胞），使细胞之间可以接合。之间可以接合。v大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）因子，简称）因子，简称col因子，带有编码因子，带有编码colicin的基因。的基因。v质粒质粒R因子上带有抗药性基因，其宿主表现出对一种或多种因子上带有抗药性基

4、因，其宿主表现出对一种或多种抗菌素或药物的抗性。抗菌素或药物的抗性。v假单孢菌中有些分解性质粒，带有分解酶类，可降解樟脑、假单孢菌中有些分解性质粒，带有分解酶类，可降解樟脑、辛烷、甲苯和二甲苯等物质。辛烷、甲苯和二甲苯等物质。v放线菌的质粒放线菌的质粒 scp 不但是致育因子，同时还不但是致育因子，同时还编码抗生素合成基因。编码抗生素合成基因。v多数质粒不显示任何表型效应，至少目前的多数质粒不显示任何表型效应，至少目前的方法和手段还测定不出来，这些质粒称为方法和手段还测定不出来，这些质粒称为隐隐秘质粒（秘质粒（cryptic plasmid）,许多细菌都有，许多细菌都有，并非无功能，只是尚未发

5、现。并非无功能，只是尚未发现。v苏云金芽孢杆菌是著名的杀虫细菌，其杀虫晶体蛋苏云金芽孢杆菌是著名的杀虫细菌，其杀虫晶体蛋白（白（Insecticidal crystal protein,ICP）基因在质粒）基因在质粒上。上。v编码杀虫晶体蛋白基因多为编码杀虫晶体蛋白基因多为 cry，还有还有 cyt 基因基因v 不同的不同的cry 基因杀虫活性不同基因杀虫活性不同v对杀虫晶体蛋白敏感的害虫有很多种，包括：鳞翅对杀虫晶体蛋白敏感的害虫有很多种，包括：鳞翅目、鞘翅目、双翅目等等。目、鞘翅目、双翅目等等。v图示图示苏云金芽孢杆菌以色列亚种的一个大质苏云金芽孢杆菌以色列亚种的一个大质粒。粒。v编码的杀

6、虫蛋白基因有编码的杀虫蛋白基因有7个，其中个，其中3个为个为cyt基基因，因，4个为个为cry基因。基因。苏云金芽孢杆菌形成的杀虫晶体蛋白苏云金芽孢杆菌形成的杀虫晶体蛋白苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白所作用的害虫苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白所作用的害虫苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白所作用的蚊虫苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白所作用的蚊虫 2、质粒的大小，数量及复制类型、质粒的大小，数量及复制类型v质粒的大小差别很大，在天然发现的质粒中，最小的只有质粒的大小差别很大，在天然发现的质粒中，最小的只有2.3kb,最大的质粒最大的质粒200kb。v质粒在细胞中的数量决定于拷贝数，而拷贝数又决定于复制质粒在细胞中的数量

7、决定于拷贝数，而拷贝数又决定于复制类型。类型。v拷贝数是指每一细胞中的质粒数量。拷贝数是指每一细胞中的质粒数量。F因子这类大质粒的拷因子这类大质粒的拷贝数只有贝数只有12个，其复制受到严格的控制。而个，其复制受到严格的控制。而col E1质粒的质粒的拷贝数在拷贝数在1020个，证明其复制不受严格的控制。个，证明其复制不受严格的控制。v拷贝数测定：拷贝数测定：细胞中质粒的总量细胞中质粒的总量/质粒的分子量质粒的分子量v复制类型复制类型:严紧型（严紧型（stringent control）质粒复制受严格的控制。如质粒复制受严格的控制。如F因子因子 松弛型（松弛型（relaxed control）质

8、粒复制不受严格的控制。如质粒复制不受严格的控制。如col因子因子v松弛型质粒可以用一定的实验手段使其拷贝数大大松弛型质粒可以用一定的实验手段使其拷贝数大大扩增。如添加氯霉素方法。扩增。如添加氯霉素方法。3、质粒的不亲和性质粒的不亲和性 （Incompatibility）v 不亲和性不亲和性是指同一细胞中的质粒不能并存的现象。是指同一细胞中的质粒不能并存的现象。v本质相同的质粒不相亲和，所以质粒分为若干个不本质相同的质粒不相亲和，所以质粒分为若干个不相容群。相容群。v不能共存在一个细胞中的质粒，属于同一不能共存在一个细胞中的质粒，属于同一不相容群不相容群，能共存的质粒属于不同的不相容群。能共存的

9、质粒属于不同的不相容群。三、质粒的分离、检测与纯化三、质粒的分离、检测与纯化 请自学此部分内容请自学此部分内容四、质粒的复制和调节四、质粒的复制和调节1、质粒的复制、质粒的复制v能够独立复制的单位称为能够独立复制的单位称为复制子（复制子（replicon）。v质粒的复制以质粒的复制以型复制为主，有单向和双向复制，型复制为主，有单向和双向复制，以及滚环复制。复制所需蛋白主要来自寄主。以及滚环复制。复制所需蛋白主要来自寄主。v质粒的复制起始位点称为质粒的复制起始位点称为 ori V。vOri 区域的功能：区域的功能：A.复制起始复制起始 B.决定宿主范围决定宿主范围 C.决定拷贝数决定拷贝数2、质

10、粒复制的调节、质粒复制的调节1）、）、抑制物抑制物靶位调节靶位调节 调节特点：调节特点：依赖一小段反向转录的依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，作为抑制物，通过与目标通过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制起始。目的互补结合阻止质粒复制起始。目标标RNA可以是复制的引物，也可以是复制所需蛋白可以是复制的引物，也可以是复制所需蛋白的的mRNA。v以以ColE1质粒为例：质粒为例：大小为大小为6.6kb,拷贝数拷贝数1020个，单向复制，完全个，单向复制，完全 依赖宿主的复制酶系。依赖宿主的复制酶系。vColE1质粒复制需要一段质粒复制需要一段RNA 引物，引物，vRNAII 为引物前体，需被为引

11、物前体，需被RNase H切割加工后才有切割加工后才有引物活性。引物活性。v质粒本身编码质粒本身编码2个负调节因子：个负调节因子：1)RNAI:是反义是反义RNA，110bp,与与RNAII 5末端互补，末端互补，形成双链结构，不被形成双链结构，不被RNase H所识别。所识别。当当RNAI基基因突变时，因突变时，ColE1质粒的拷贝数可从质粒的拷贝数可从20个增加至个增加至250个。个。2）Rop蛋白蛋白：含有：含有63个氨基酸，以二聚体形式增强和个氨基酸，以二聚体形式增强和促进促进RNA I 和和RNA II 形成双链。形成双链。v复制原点复制原点：RNA与与DNA 的转换处vRNA II

12、延伸至复制原点时，被延伸至复制原点时，被RNase H切割，产生切割，产生3-OH末端，聚合酶以此作为引物合成末端，聚合酶以此作为引物合成DNA。ColE1质粒的复制调控质粒的复制调控vColE1复制需要复制需要RNA引物引物RNAII，从复制原点上游，从复制原点上游555bp处开始转录。处开始转录。vColE1编码编码2个负调节因子：个负调节因子：Rop蛋白和反义蛋白和反义RNARNAI。vRNAI 的转录起始于复制原的转录起始于复制原点上游点上游445bp处，转录方向处，转录方向与与RNAII相反。因此，与相反。因此，与RNAII末端末端111bp互补。互补。vRop蛋白促进蛋白促进RNA

13、I与与RNAII结合，抑制质粒的复制。结合，抑制质粒的复制。vRNAI由质粒编码，质粒数量多，由质粒编码，质粒数量多，RNA I分子分子也多，有效的也多，有效的干扰干扰RNA II的加工的加工，便可抑制，便可抑制质粒的复制。质粒的复制。v当当RNAI基因突变时，会增进引物的合成和质基因突变时，会增进引物的合成和质粒的复制。质粒拷贝数可从粒的复制。质粒拷贝数可从20个左右增加至个左右增加至250多个。多个。2）、重复子竞争结合调节）、重复子竞争结合调节调节特点：调节特点：v重复子（重复子（iteron）:质粒复制起始位点和复制基因质粒复制起始位点和复制基因（rep）附近的）附近的DNA短片段，长

14、度为短片段，长度为1722bp。v重复子可与复制必需的蛋白重复子可与复制必需的蛋白Rep竞争性结合，从而竞争性结合，从而抑制质粒的复制和拷贝数的增加。抑制质粒的复制和拷贝数的增加。v含有重复子的质粒称为重复子质粒（含有重复子的质粒称为重复子质粒（iteron plasmid），通常含有），通常含有37个重复子。个重复子。图图59 重复子质粒重复子质粒ori区和区和rep基因的结构基因的结构 调节方式：调节方式：1）转录自体调控）转录自体调控（transcriptional autoregulation），是），是RepA蛋白与蛋白与repA启启动子区内的反向重复序列动子区内的反向重复序列IR1

15、、IR2结合而抑结合而抑制制RepA自身的合成的过程。自身的合成的过程。2）偶联模型）偶联模型（coupling model）由于重复子序列间的相互作用，使由于重复子序列间的相互作用，使2个质粒偶个质粒偶联在一起，从而抑制质粒复制的起始。联在一起，从而抑制质粒复制的起始。图图510 3）、质粒之间的不相容性）、质粒之间的不相容性 v不相容性不相容性是指在同一细胞中的质粒不能共存是指在同一细胞中的质粒不能共存的现象。的现象。v目前认为质粒的不相容性与复制、调控和分目前认为质粒的不相容性与复制、调控和分配有关。配有关。v复制调控机制相同的质粒，可能产生相同的复制调控机制相同的质粒，可能产生相同的阻

16、遏物，使得它们不能在同一细胞中共存下阻遏物，使得它们不能在同一细胞中共存下去，则认为属于同一个不相容群。去，则认为属于同一个不相容群。v复制调控机制不相同的质粒，形成各自不同复制调控机制不相同的质粒，形成各自不同的阻遏物，互不干扰，可在同一细胞中共处，的阻遏物，互不干扰，可在同一细胞中共处，则认为属于不同的不相容群。则认为属于不同的不相容群。五、质粒的稳定性五、质粒的稳定性（细胞分裂中的质粒分配）（细胞分裂中的质粒分配）v质粒的稳定性包括分离稳定性和结构稳定性质粒的稳定性包括分离稳定性和结构稳定性v分离稳定性与细胞分裂中的质粒分配机制有关分离稳定性与细胞分裂中的质粒分配机制有关v要保持质粒的稳

17、定性，每一细胞世代质粒必需复制要保持质粒的稳定性，每一细胞世代质粒必需复制1次，且能够平均分配到次，且能够平均分配到2个子细胞中个子细胞中v质粒分配途径有质粒分配途径有主动分配主动分配和和随机分配随机分配2种方式种方式1、主动分配机制、主动分配机制v低拷贝数质粒的稳定性决定于低拷贝数质粒的稳定性决定于2种机制。由种机制。由2类基因类基因控制。主动分配体系控制。主动分配体系par和寄主致死体系和寄主致死体系ccdvpar区称为分配区或分配座位（区称为分配区或分配座位（partition region or partition locus）。是一段质粒）。是一段质粒DNA序列，其功能序列，其功能是

18、确保质粒的数量均等的分配到分裂后的子细胞中。是确保质粒的数量均等的分配到分裂后的子细胞中。vF因子的因子的par区与复制起点紧密相连。有区与复制起点紧密相连。有3个基因：个基因：sopA,sopB,sopC。其中。其中sopA,sopB编码编码反式作用蛋反式作用蛋白白，sopC为顺式作用位点，也称为为顺式作用位点，也称为类着丝粒位点类着丝粒位点。（图（图513）vsopA与与sopB构成一个转录单位，构成一个转录单位，sopA与启动区域结合，控与启动区域结合，控制制2个蛋白的转录。属自体阻遏控制。个蛋白的转录。属自体阻遏控制。vsopB蛋白起到促进蛋白起到促进sopA与启动区域结合的作用。与启

19、动区域结合的作用。sopA、sopB缺一不可。缺一不可。v sopC由由12个正向重复序列组成，每个含有个正向重复序列组成，每个含有43个个bp，其中又，其中又包含反向重复序列。包含反向重复序列。v sopB与与 sopC区结合形成核酸蛋白复合物，称为区结合形成核酸蛋白复合物，称为分配复合体分配复合体。v分配复合体在细胞分裂时将分配复合体在细胞分裂时将2个质粒移向细胞两级。个质粒移向细胞两级。vsopA与启动区域结合，控制与启动区域结合，控制2个蛋白的转录。个蛋白的转录。sopB蛋白起到这一结合的促进作用。蛋白起到这一结合的促进作用。sopA、sopB缺一缺一不可。不可。质粒主动分配模型见图质

20、粒主动分配模型见图514vSopB与与sopC区结合形区结合形成核酸蛋白复合物，成核酸蛋白复合物，称为称为分配复合体分配复合体。v分配复合体在细胞分裂分配复合体在细胞分裂时将时将2个质粒移向细胞个质粒移向细胞两级。两级。寄主致死体系寄主致死体系vF因子基因组中控制寄主致死功能的基因有因子基因组中控制寄主致死功能的基因有2个：个：ccdA,ccd B，属同一个操纵子，操纵子表达属自我调节。，属同一个操纵子，操纵子表达属自我调节。vCcdA 蛋白分子量蛋白分子量8.3 kD，是解毒剂，是解毒剂，与与CcdB蛋白特异结合，蛋白特异结合，使其失效。使其失效。vCcdB蛋白分子量蛋白分子量11.7 kD

21、，是毒剂蛋白，抑制，是毒剂蛋白，抑制DNA解旋酶活解旋酶活性，并可引发解旋酶诱导宿主染色体性，并可引发解旋酶诱导宿主染色体DNA双链断裂，破坏染双链断裂，破坏染色体的正确分配，导致细胞死亡。色体的正确分配，导致细胞死亡。寄主致死体系的调节寄主致死体系的调节v在无质粒的细胞中，起初在无质粒的细胞中，起初2种蛋白浓度相同。但随种蛋白浓度相同。但随细胞分裂而逐渐稀释。细胞分裂而逐渐稀释。v解毒剂解毒剂CcdA 蛋白蛋白 与与 毒剂毒剂CcdB蛋白具有不同的稳蛋白具有不同的稳定性，这是导致细胞致死的关键因素。定性，这是导致细胞致死的关键因素。vCcdA 蛋白不稳定，易被蛋白酶水解，浓度越来越蛋白不稳定

22、，易被蛋白酶水解，浓度越来越低。低。vCcdB蛋白不被蛋白酶水解，又失去蛋白不被蛋白酶水解，又失去CcdA 蛋白的解蛋白的解毒作用，便可行驶对细胞的致死作用。毒作用，便可行驶对细胞的致死作用。2、质粒的随机分配、质粒的随机分配2、随机分配机制、随机分配机制v多拷贝质粒的分配一般是随细胞分裂而随机分配。多拷贝质粒的分配一般是随细胞分裂而随机分配。v随机分配的质粒也能够稳定遗传，但在细胞分裂中随机分配的质粒也能够稳定遗传，但在细胞分裂中会出现无质粒的细胞。会出现无质粒的细胞。v质粒的多聚体影响质粒的随机分配。质粒的多聚体影响质粒的随机分配。vCol因子上的因子上的cer基因产物使质粒解聚，变为单体。基因产物使质粒解聚，变为单体。v对人工构建的载体质粒如何保持其稳定性？对人工构建的载体质粒如何保持其稳定性？谢谢！谢谢！