质粒DNA提取-课件.ppt

1、质粒DNA提取 质粒基础知识一一目 录 提取方法及条件三三 提取流程四四 常见问题解答五五 质粒的构建及应用二二1.质粒的定义2.质粒的分类 质粒基础知识一一目 录 提取方法及条件三三 提取流程四四 常见问题解答五五 质粒的构建及应用二二1.1 质粒的定义质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。41.1 质粒的定义大部分的质粒都是环状构型。1984年，在放线菌中发现线形质粒。存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。5天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。

2、一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。1.1 质粒的定义1.2 质粒的分类*抗各种抗生素，抗重金属离子(汞，镉，镍，钴，锌，砷)1.质粒、载体的特点2.质粒的构建3.质粒的应用 质粒基础知识一一目 录 提取方法及条件三三 提取流程四四 常见问题解答五五 质粒的构建及应用二二92.1 质粒的特点质粒具有自我复制的能力。质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。质粒可自行丢失与消除。质粒的转移性。质粒可分为相容性与不相容性两种。2.1 载体的特点具有复制起点。携带易于筛选的选择标记。具备合适的酶切位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。质粒作

3、为基因工程载体必须具备的条件质粒作为基因工程载体必须具备的条件2.2 质粒的构建（分离目的基因）（切割目的基因和载体）（连接目的基因和载体）（转化宿主细胞）（筛选标记基因）（表达目的基因）（DNA分子克隆）2.3 质粒的应用运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。2.3 质粒的应用基因工程基因工程质粒载体分类克隆载体表达载体用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。例如：pBR322质粒载体，pUC18,pUC19,pGEM-3Z/4Z.添加了强启动子，及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件，用于生产蛋白质。2.3 质粒的应用目前实

4、验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：8.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因Tcr6.5kb拷贝数2030大肠杆菌内毒素标记基因E1COlE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因 Apr1.提取方法2.试剂3.耗材4.设备 质粒的定义及分类一一目 录 提取方法及条件三三 提取流程四四 常见问题解答五五 质粒的构建及应用二二3.1 提取方法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染1.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 2.加溶菌酶裂解细菌细胞壁3.加CsCl和溴乙锭4.超速离心过夜5.在紫外灯下吸取cccDNA6.稀释沉淀cccDNApro

5、teinsocDNAL-DNAcccDNARNAs3.1 提取方法沸水浴法沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间1.用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 2.加溶菌酶裂解细菌细胞壁3.沸水浴40秒钟4.离心，用无菌牙签挑去沉淀物5.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA3.1 提取方法碱溶法碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便3.2 试剂产品组成溶液P1（Buffer P1）溶液P2（Buffer P2）溶液P5（Buffer P5）漂洗液PWT（Buffer PWT）洗脱缓冲液TB（Buffer TB）Rnase A(10mg/mL)TIANRed吸附柱CP3（S

6、pin Columns CP3)收集管（Collection Tubes 2mL)3.2 耗材各种规格枪头、移液枪PCR管1.5mLEP管PCR板双面板3.3 仪器超净工作台离心机 高压灭菌锅 电热恒温鼓风干燥箱3.3 仪器 水平电泳仪摇床3.3 仪器凝胶成像系统微波炉3.3 仪器1.提取流程2.注意事项 质粒基础知识一一目 录 提取方法及条件三三 提取流程四四 常见问题解答五五 质粒的构建及应用二二4.1 提取流程4.1.1 菌液收集菌液较多时 可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。取1-4mL菌液，加入离心管中12000rpm，离心1min吸除上清1234.1.2 去除RNA，重悬

7、向留有菌体沉淀的离心管中加入150L溶液P1使用移液器或涡旋振荡器重悬12加入P1前检查是否 已加入RNase A和TIANRed。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。TIANRed试剂的加入对于后续PCR、酶切和测序都没有影响。使用时按照TIANRed:溶液P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加入到收集好的菌体中彻底混匀，由于菌体的存在，混匀后的溶液为浑浊的红色。4.1.3 裂解菌体向离心管中加入150L溶液P2温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解12温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果

8、未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。由于使用了TIANRed，添加溶液P2彻底混匀后，溶液的颜色为澄清的紫色。如果在紫色中混杂有混杂的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫色。4.1.4 去除蛋白质、多糖向离心管中加入350L溶液P51立即快速上下颠倒混匀12-20次，充分混匀。2出现絮状沉淀。12000rpm，离心2min3加入溶液P5后应立即混合，应快速上下颠倒混匀，避免产生局部沉淀。上清中含有少量微小白色沉淀对后续实验没有任何影响。如果上清中存在大量微小白色沉淀，可再次离心后取上清。由于使用了TIANRed，添加溶液P5彻底混匀后，溶液为澄清的黄

9、色，如果在黄色中混有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。4.1.5 吸附柱吸附DNA 将上清液转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）1注意尽量不要吸沉淀，12000rpm，离心30sec2倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中34.1.6 去除无机盐向吸附柱CP3中加入300L漂洗液PWT112000rpm，离心30sec2倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中312000rpm，离心1min4倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入干净的离心管中5第二次离心的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。4.1.7 收集DNA向吸附膜中间部位滴加50-100L洗脱缓冲液TB11

10、2000rpm，离心30sec2将质粒溶液收集到离心管中3洗脱缓冲液体积不应少于50L，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。4.1.8 琼脂糖凝胶电泳原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1、电荷效应 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。2、分子筛效应 不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。3、待分离生物大分子的性质 一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。4、电场强度 电场强度（V/cm）是每厘米的电

11、位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。4.1.8 琼脂糖凝胶电泳不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围琼脂糖浓度（）DNA有效分离范围（Kb）0.53010.7120.81.0100.51.270.41.530.24.1.8 琼脂糖凝胶电泳在锥形瓶中加入1mL 50 xTAE、49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷却至不烫手；加入2.5LNuclleic Acid Stain核酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝固。琼脂糖凝胶制作上样电泳取1L上样缓冲液与5L产物混匀垂直加入上样孔中。电泳条件：140V，20min。4.1.9

12、结果分析将电泳结束后的凝胶放在凝胶成像 系统中拍照保存。对结果进行分析：看有无目的带看是否存在非特异带看条带亮度4.2 注意事项使用前请先检查溶液P2和P5是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。2注意不要直接接触溶液P2和P5，使用后应立即盖紧盖子。3所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12000rpm。4溶液P1在使用前先加入RNase A和TIANRed（将试剂盒中提供的RNase A和TIANRed 全部加入），混匀，置于2-8保存。14.2 注意事项TIANRed的使用方法：TIANRed是一种指示剂，用以指示整个操作的正确性，对人体无

13、害。使用时按照TIANRed：溶液P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加入到收集好的菌体中彻底混匀，溶液的颜色为澄清的紫色，则说明充分裂解；再添加溶液P5至彻底混匀后，溶液为澄清的黄色，说明中和复性充分。6提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。5 质粒基础知识一一目 录 提取方法及条件三三 提取流程四四 常见问题解答五五 质粒的构建及应用二二常见问题解答1.裂解时间太长：加入溶液P2后裂解时间不超过5min.2.吸附时间不够3.溶解时间不够4.大肠杆菌老化：建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。5.质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数

14、载体引起的质粒DNA提取量低。6.菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。7.溶液使用不当：溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。质粒提取质粒提取不成功不成功常见问题解答8.吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分次提取。9.质粒未全部溶解：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。10.漂洗液残留11.洗脱液加入位置不正确12.洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱。13.洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。

15、为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。14.混有蛋白：不要使用过多菌体。溶液1、P2、P5处理并离心后溶液应为澄清的，如还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。质粒提取质粒提取不成功不成功常见问题解答加入裂解液的时候颠倒混匀的动作幅度太大，会导致基因组DNA断裂成小片段，和质粒混在一起。沉淀以后，吸取上清液的时候不小心吸入沉淀，会把夹在沉淀中的基因组DNA也一起吸入吸附柱中。这一步的可能性更大，容易混入基因组DNA。有少量的基因有少量的基因组组DNADNA污染污染质粒DNA提取标准流程-试剂耗材与设备快速质粒小提试剂盒产品组成溶液P1（Buffer P1）溶液P2（Buffer

16、P2）溶液P5（Buffer P5）漂洗液PWT（Buffer PWT）洗脱缓冲液TB（Buffer TB）Rnase A(10mg/mL)TIANRed吸附柱CP3（Spin Columns CP3)收集管（Collection Tubes 2mL)耗材各种规格枪头、移液枪PCR管1.5mL EP管PCR板双面板设备超净工作台离心机高压灭菌锅鼓风干燥箱水平电泳仪摇床凝胶成像系统微波炉质粒DNA提取标准流程-操作流程取1-4mL菌液，加入离心管中12000rpm，离心1min吸除上清向留有菌体沉淀的离心管中加入150L溶液P1使用移液器或涡旋振荡器重悬向离心管中加入150L溶液P2温和地上下翻

17、转6-8次使菌体充分裂解质粒DNA提取标准流程-操作流程向离心管中加入350L溶液P5立即快速上下颠倒混匀12-20次，充分混匀。出现絮状沉淀。12000rpm，离心2min将上清液转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）尽量不要吸沉淀，12000rpm，离心30sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中质粒DNA提取标准流程-操作流程向吸附柱CP3中加入300L漂洗液PWT12000rpm，离心30sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中12000rpm，离心1min倒掉废液，将吸附柱放入干净的离心管中向吸附膜中间部位滴加50-100L洗脱缓冲液TB12000rpm，离心30sec将质粒溶液收集到离心管中质粒DNA提取标准流程-操作流程在锥形瓶中加入1mL 50 xTAE、49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷却至不烫手；加入2.5LNuclleic Acid Stain核酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝固。琼脂糖凝胶制作上样电泳取1L上样缓冲液与5L产物混匀垂直加入上样孔中。电泳条件：140V，20min。