第四讲-基因工程动物细胞培养制药工艺课件.ppt

1、第四讲第四讲 基因工程动物细胞培养制药工艺基因工程动物细胞培养制药工艺药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。人畜病毒疫苗人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病

2、疫苗、牛白血病和脊髓口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。灰质炎、乙肝疫苗。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激、尿激酶、人生长因子等。酶、人生长因子等。第一节第一节 动物细胞制药的表达系统与特征动物细胞制药的表达系统与特征 昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。一、哺乳动物细胞表达系统与特征一、哺乳动物细胞

3、表达系统与特征1.动物细胞的特征动物细胞的特征细胞膜、细胞质细胞膜、细胞质和细胞核和细胞核没有细胞壁。没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。亚细胞器，功能独特。2.动物细胞代谢动物细胞代谢 动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换。间的交换。在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合

4、成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其他氨基酸的消耗得以补偿。他氨基酸的消耗得以补偿。糖代谢特点：糖代谢特点：动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。在培养液中积累。丙酮

5、酸还可转化为乙酰辅酶丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底，进入三羧酸循环，彻底氧化产生氧化产生CO2和水。小部分（和水。小部分（48）葡萄糖进入戊）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。氨基酸代谢特点：氨基酸代谢特点：吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨吸收谷氨酰

6、胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物-酮戊二酸，进酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨

7、酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。是主要的代谢途径。不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。来源于谷氨酰胺。在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以在连续细胞系中，没有

8、这种流动。能量是以ATP和和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。废物积累。3.蛋白质糖基化蛋白质糖基化蛋白质合成是以蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白为模板，在核糖体上完成。而蛋白质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的寡糖结构容易发质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的寡糖结构容易发生变化。生变化。糖蛋白的单糖单元糖蛋白的单糖单

9、元:-D-葡萄糖、葡萄糖、-D-半乳糖、半乳糖、-D-甘露甘露糖、糖、-D-木糖、木糖、-D-岩藻糖、岩藻糖、N-乙酰乙酰-D-葡萄糖胺、葡萄糖胺、N-乙酰乙酰-D-半乳糖胺和半乳糖胺和-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸乙酰神经氨酸（或唾液酸）。）。糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的糖基化。这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同。位点和数量及糖的种类都不同。N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体的保

10、守序列为的保守序列为Asn-X-Thr/Ser(X为除脯氨酸以外的任意氨为除脯氨酸以外的任意氨基酸基酸)。如果。如果X为为Trp、Asp、Glu和和Leu，对糖基化有负影，对糖基化有负影响，而第三位响，而第三位Thr能增强糖基化。能增强糖基化。N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同核心是同核心是3个甘露糖和个甘露糖和2个个N-乙酰葡萄糖胺组成的乙酰葡萄糖胺组成的5糖糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支链。），其他糖形成支链。高甘露糖型的支链为甘露聚糖（高甘露糖型的支链为甘露聚糖（59聚体），无其他糖。聚体），无其他糖。复合型

11、含有复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。酸等。杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。O-聚糖连接在聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。的羟基上，还没有发现保守序列。O-聚糖有四种不同的核心结构，都含有聚糖有四种不同的核心结构，都含有N-乙酰半乳糖胺乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。O-糖基化比较小，一般为糖基化比较小，一般为16个寡聚糖，但比个寡聚糖，但比N-糖基化糖基化变化更大。变化更大。O-糖基化只在高尔基体上进

12、行，糖基单元有木糖、葡萄糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。糖。糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用，都具有相同的核心结构：胆胺的相互作用，都具有相同的核心结构：胆胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇肌醇-PO4-脂。脂。胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白，可切割此类蛋白，有利于纯化。有利于纯化。细胞特异性糖基化途径细胞特异性糖基化途径淋巴细胞中进行，它不依赖于淋巴细胞中进行，它不依赖于

13、内质网和高尔基体。内质网和高尔基体。IgG的糖基化，等分的糖基化，等分GlcNAc残基连接在核心甘露糖上，该残基连接在核心甘露糖上，该糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。IgG蛋白的铰链区，富含蛋白的铰链区，富含Ser、Thr和和Pro，5个个Ser全部糖全部糖基化。基化。促黄体激素、促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生。促黄体激素、促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生。尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞系，糖基化特征不同。系，糖基化特征不同。鼠和猪细胞倾向于添加乙

14、酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。CHO细胞不能合成等分细胞不能合成等分N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。细胞系细胞系Fuc Gal唾液酸唾液酸1,6 1,3 Fuc1,3GalS O4-GalNAc 2,3 2,6糖 基糖 基化化等分等分GluNAcBHK+0+0+0-0CHO+-00+0+

15、0鼠杂交瘤鼠杂交瘤+0+0+0+0C127+0+0J558L+0+-+0人淋巴细胞人淋巴细胞+000+0+人垂体人垂体+00+0+Namalwa+000+-人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤+000+02.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力的无限生长细胞基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力的无限生长细胞系，即永久性细胞。表达的蛋白质能正确加工、修饰并折系，即永久性细胞。表达的蛋白质能正确加工、修饰并折叠形成具有生物活性的功能分子，接近或类似天然产物。叠形成具有生物活性的功能分子，接近或类似天然产物。糖基化等修饰是糖蛋白行使功能所必需的，而且对产品质糖基化等修饰是糖蛋

16、白行使功能所必需的，而且对产品质量有影响，如生物活性、稳定性、免疫原性等。原核细胞量有影响，如生物活性、稳定性、免疫原性等。原核细胞表达的表达的EPO无糖基化，在体内表现无活性。原核表达的无糖基化，在体内表现无活性。原核表达的GMCSF虽有活性，但在体内产生抗体。虽有活性，但在体内产生抗体。动物细胞表达产物分泌到培养液，容易分离纯化。约有动物细胞表达产物分泌到培养液，容易分离纯化。约有70批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造，而且批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造，而且数目还在不断增加。数目还在不断增加。表达系统表达系统O-糖基化糖基化寡聚甘露糖寡聚甘露糖高甘露糖高甘露糖复合体复

17、合体大肠杆菌大肠杆菌0000酿酒酵母酿酒酵母0 昆虫昆虫Sf90仓鼠仓鼠CHO0仓鼠仓鼠BHK0鼠杂交瘤鼠杂交瘤0鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤0C1270J558L0人淋巴细胞人淋巴细胞00Namalwa0人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤0 大肠杆菌大肠杆菌酵母酵母哺乳动物细胞哺乳动物细胞产物浓度产物浓度高高高高低低分子量分子量低低高高高高二硫键二硫键有限有限不受限制不受限制不受限制不受限制分泌分泌无无有或无有或无有有形式形式包涵体包涵体单链，天然单链，天然单链，天然单链，天然折叠折叠不正确不正确正确正确正确正确糖基化糖基化无无可能可能完全完全逆转录病毒逆转录病毒无无无无可能可能热原热原可能可能无无无无培养特点培养特

18、点容易容易容易容易较难，成本高较难，成本高分离纯化分离纯化复杂复杂复杂复杂简单简单细胞类型细胞类型表达水平表达水平（g/ml）猴猴CV1110猴猴CV10.05猴猴COS1小鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞C12715小鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞3T30.10.5CHO（dhfr）0.010.05CHO（dhfr）10动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢，生产效率较低，动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他表达系统。产量远远落后于其他表达系统。骨髓细胞骨髓细胞MPG11生产生产IgG的能力为的能力为5pg/(细胞细胞.分钟分钟)，10L反应器，密度为反应器，密度为10

19、7/ml，生产能力不到，生产能力不到1g/d。连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。的增加。动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗、渗透压、剪切力等忍受能力差。培养基要求高，需要添加氨透压、剪切力等忍受能力差。培养基要求高，需要添加氨基酸、维生素等，往往需要附加血清，提供生长因子，费基酸、维生素等，往往需要附加血清，提供生长因子，费用较高。同时可能有潜在的致病因子、免疫原性存在。用较高。同时可能有潜在的致病因子、免疫原性存在。表达载体的改进和宿主细胞的改造是动物细胞表达系

20、统的表达载体的改进和宿主细胞的改造是动物细胞表达系统的研发重要内容。研发重要内容。3.昆虫细胞表达系统与特征昆虫细胞表达系统与特征表达载体为昆虫病毒，转染昆虫细胞，表达出目标蛋白质。表达载体为昆虫病毒，转染昆虫细胞，表达出目标蛋白质。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统，家蚕核多苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统，家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统。角体病毒家蚕幼虫表达系统。MicroGene Sys公司表达艾滋病基因工程疫苗，随后猪公司表达艾滋病基因工程疫苗，随后猪生长素、生长素、CD4膜蛋白及疟疾疫苗、鸡新城病

21、毒疫苗、血吸膜蛋白及疟疾疫苗、鸡新城病毒疫苗、血吸虫虫GST疫苗、乙肝表面抗原、重组人疫苗、乙肝表面抗原、重组人GMCSF等。日本等。日本批准用家蚕系统生产干扰素已上市。生物试剂盒的标准品批准用家蚕系统生产干扰素已上市。生物试剂盒的标准品大多用昆虫表达系统生产。大多用昆虫表达系统生产。至少有至少有600多种昆虫可以作为宿主，每年有数百个基因利多种昆虫可以作为宿主，每年有数百个基因利用昆虫系统进行表达，越来越成为非常有用的表达宿主。用昆虫系统进行表达，越来越成为非常有用的表达宿主。优点优点1）安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受）安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDA认可。认可。2）易饲养：

22、家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快，）易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快，3）高量表达：用强启动子，外源基因可超量表达。表达）高量表达：用强启动子，外源基因可超量表达。表达产物在昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。产物在昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。4）高效表达：可容纳较大的外源基因（）高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb），表达数），表达数个外源基因，并且正确装配成有功能的分子。如表达抗体个外源基因，并且正确装配成有功能的分子。如表达抗体的重链和轻链，自主装配成有功能的抗体。的重链和轻链，自主装配成有功能的抗体。5）翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工

23、，）翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，包括糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸的乙酰化、包括糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸的乙酰化、氨酰化等，大部分产物显示出良好的活性。氨酰化等，大部分产物显示出良好的活性。缺点：缺点：1）重组率低，筛选困难，周期长，需要）重组率低，筛选困难，周期长，需要410天。天。2）外源基因的表达在转染的晚期，大约在）外源基因的表达在转染的晚期，大约在20h后起始基因后起始基因表达，在表达，在7294h细胞裂解死亡，基因表达时间约细胞裂解死亡，基因表达时间约3050h，高水平表达不连续且时间短，这对表达不利。，高水平表达不连续且时间短，这对表达不利。

24、3）昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相）昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相同，它不提供复杂的同，它不提供复杂的N糖基化，如添加半乳糖和唾液酸残糖基化，如添加半乳糖和唾液酸残基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等变化。表达水基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等变化。表达水平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。第二节第二节 基因工程动物细胞系

25、的构建基因工程动物细胞系的构建构建高效表达载体构建高效表达载体转染动物细胞转染动物细胞筛选鉴定筛选鉴定获得生产用工程化细胞系获得生产用工程化细胞系动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。病毒载体：病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。始病毒改造而来。同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间较长。较长。痘病毒载体可插入痘病毒载体可插入2540 kb外源基因，甚至是多个基因。外源基因，甚至是多个基因。无感染性和致

26、癌性，可用于构建基因工程疫苗。无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。美国美国Genentech公司已用公司已用SV40载体生产乙肝疫苗，其他载载体生产乙肝疫苗，其他载体可用于基因治疗。体可用于基因治疗。质粒载体：质粒载体：微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。子和抗性筛选标记基因。大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。抗生素抗性标记，原核细胞筛选。抗生素抗性标记，原核细胞筛选。动物细胞的复制子动物细胞的复制子，在宿主细胞中稳定表达。在宿主细胞中稳定表达。还有丝状噬菌体复制子还有丝状噬菌

27、体复制子。启动子序列：含有启动子序列：含有RNA聚合酶识别和结合位点，以便有聚合酶识别和结合位点，以便有效转录。效转录。TATA盒，确定起始位置；盒，确定起始位置；GG盒，影响转录频盒，影响转录频率。率。来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子。来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子。动 物 病 毒 启 动 子：逆 转 录 病 毒 的 长 末 端 重 复 序 列动 物 病 毒 启 动 子：逆 转 录 病 毒 的 长 末 端 重 复 序 列（LTRS）、）、SV40病毒的早期和晚期启动子、腺病毒的晚病毒的早期和晚期启动子、腺病毒的晚期启动子、人巨噬病毒（期启动子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因启动子

28、。）立即早期基因启动子。动物基因的启动子：转录因子动物基因的启动子：转录因子EF-1启动子、泛素蛋白启启动子、泛素蛋白启动子、动子、-肌动蛋白启动子、干扰素肌动蛋白启动子、干扰素-启动子、启动子、IgG启动子、启动子、鼠金属硫蛋白基因启动子等。鼠金属硫蛋白基因启动子等。噬菌体噬菌体T7启动子比动物基因启动子表达水平高。启动子比动物基因启动子表达水平高。PolyA信号序列：保持信号序列：保持mRNA的稳定性，防止降解，保证的稳定性，防止降解，保证了转录产物的加工和正确性，但序列不宜太长，避免能量了转录产物的加工和正确性，但序列不宜太长，避免能量过度消耗。添加过度消耗。添加PolyA信号和信号和5

29、端转录暂停位点，可以减端转录暂停位点，可以减少上游序列转录通读造成的背景。少上游序列转录通读造成的背景。牛生长素（牛生长素（BGH）基因的）基因的PolyA信号比信号比SV40 PolyA更强，更强，常用于高效表达载体中。常用于高效表达载体中。终止序列：终止序列：AAUAAA或连续的终止密码或连续的终止密码UGA、UAA和和UAG，能防止转录通读，使转录在正确的位点结束。，能防止转录通读，使转录在正确的位点结束。在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子，有利于在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子，有利于提高外源基因的转录水平。提高外源基因的转录水平。双顺反子表达载体：双顺反子表达载体：

30、两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点使同一使同一mRNA中的第二个基因得到翻译。将中的第二个基因得到翻译。将dhfr与目标与目标基因串连，基因串连，dhfr的的cDNA插入内含子中，其转录产物被剪插入内含子中，其转录产物被剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有广泛应用前景。广泛应用前景。使筛选容易，而且能高效表达。使筛选容易，而且能高效表达。选择适宜的启动子，可实现定向表达。选

31、择适宜的启动子，可实现定向表达。CMV启动子和人启动子和人EF-1启动子，可实现同一载体上的二个启动子，可实现同一载体上的二个基因的独立表达。基因的独立表达。组织特异性启动子：如鼠、山羊酪蛋白启动子，可使基因组织特异性启动子：如鼠、山羊酪蛋白启动子，可使基因主要在乳腺中表达。主要在乳腺中表达。N端设计分泌信号肽：如端设计分泌信号肽：如Ig 链的可变区和恒定区之间序链的可变区和恒定区之间序列，使外源基因的表达产物向胞外分泌。列，使外源基因的表达产物向胞外分泌。C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细

32、胞核、线粒亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核、线粒体、内质网或细胞质中，这对基因的功能研究非常合适。体、内质网或细胞质中，这对基因的功能研究非常合适。基因的扩增系统：基因的扩增系统：在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因水平。水平。最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（DHFR）基因系统和）基因系统和谷氨酰氨合成酶（谷氨酰氨合成酶（GS）基因系统。）基因系统。氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使氨甲喋呤基因与

33、目标基因重组，氨甲喋呤使dhfr基因与基因与目标基因大量增加，达到数千拷贝。目标基因大量增加，达到数千拷贝。硫胺蛋氨酸使硫胺蛋氨酸使GS系统的基因得到大量扩增。系统的基因得到大量扩增。二、受体细胞二、受体细胞1人源细胞株系人源细胞株系Namalwa：类淋巴母细胞，非整体核型。表达：类淋巴母细胞，非整体核型。表达IgM，悬浮，悬浮生长。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密生长。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密度培养，已成功地表达了度培养，已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英等。英国国Wellcome公司用公司用Namalwa细胞的反应器达细胞的反应器达800

34、0L，用，用Sendai病毒诱导，大规模生产病毒诱导，大规模生产干扰素，并批准上市。干扰素，并批准上市。WI-38：二倍体成纤维细胞系，：二倍体成纤维细胞系，2n=46，第一个被用于制，第一个被用于制备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。MRC-5：二倍体成纤维细胞系，但生长较：二倍体成纤维细胞系，但生长较WI-38快，对逆快，对逆境有一定抗性也用于制备疫苗。境有一定抗性也用于制备疫苗。2哺乳动物细胞株系哺乳动物细胞株系CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁型生长，是目前使

35、用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还

36、原酶缺陷株表达的药物有氨酸。二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、疫苗、G-CSF、凝血因子、凝血因子、DNA酶酶，已上市。，已上市。使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。达水平。BHK21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表达表达的重组凝血因子的重组凝血因子已被获准上市。已被获准上市。C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴壁：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上

37、皮样细胞，贴壁型生长。型生长。C127细胞系已表达多种外源基因，其中细胞系已表达多种外源基因，其中EPO的的水平达水平达10 mg/L，生产，生产rhGH已被批准上市。已被批准上市。3T3：HIN Swiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：J558LJ558L是小鼠是小鼠BALB/cBALB/c骨髓瘤细胞，分泌骨髓瘤细胞，分泌IgAIgA，用于转染研究。用于转染研究。NSONSO和和SP2/OSP2/OAg14Ag14不分泌不分泌IgIg，

38、与淋巴细胞，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生离获得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。VeroVero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多

39、倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6Vero E6增殖多种病毒，增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。COSCOS：是从：是从SV40 DNASV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞转化的非洲绿猴肾细胞CV1CV1中分离

40、得到中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。GH3GH3用于生长激素研究，用于生长激素研究，293293细胞系用于基因治疗的研究。细胞系用于基因治疗的研究。3昆虫细胞株系昆虫细胞株系Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。放大，高效表达外源基因。Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞（：从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最常）中分离得到，是最常用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血

41、清培养基的高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比Sf9细胞系细胞系高高20多倍，能适应悬浮培养。多倍，能适应悬浮培养。三、细胞转染三、细胞转染转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。基因导入真核细胞的方法很多，主要有化学转染、物理转基因导入真核细胞的方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导的转化。染和病毒介导的转

42、化。方法方法表 达 类表 达 类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点基因枪基因枪瞬 时，瞬 时，稳定稳定无无多种细胞组多种细胞组织，器官织，器官有效，仪器有效，仪器操作操作显微注射显微注射瞬 时，瞬 时，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有效，技术有效，技术难度大难度大电穿孔电穿孔瞬 时，瞬 时，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有效，仪器有效，仪器操作操作冲击波冲击波瞬 时，瞬 时，稳定稳定无无多种细胞，多种细胞，局部组织局部组织简单有效，简单有效，仪器操作仪器操作方法方法表达类表达类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点逆 转 录 病逆 转 录 病毒毒瞬时，瞬时，稳定稳定无无对应的宿主对应的宿主细胞细胞

43、有效有效原 生 质 体原 生 质 体融合融合瞬时，瞬时，稳定稳定无无悬浮细胞悬浮细胞技术复杂技术复杂生物转染特点生物转染特点化学转染是最常用的转染方法。化学转染是最常用的转染方法。其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖）葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。磷酸钙与磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的形成不溶性沉淀，带正电荷的DEAE葡聚葡聚糖与带负电荷的糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹磷酸基团结合

44、，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。形成脂质体。渗透性休克和渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进等化学试剂能促进DNA进入细胞。进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。影响因素：细胞培养物的密度、影响因素：细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。方法方法表 达 类表 达 类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点磷酸钙磷酸钙瞬 时、瞬 时、稳定稳定无无贴壁细胞，贴壁细胞，悬浮细胞悬浮细胞简单简单DEAE-葡聚葡聚糖糖瞬时瞬时

45、有有CV1，COS简单简单阳离子树脂阳离子树脂瞬 时、瞬 时、稳定稳定有 或有 或无无贴壁、原代贴壁、原代悬浮细胞悬浮细胞简单，有效简单，有效化学转染的特点化学转染的特点四、转染体筛选与分离四、转染体筛选与分离转染后转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。交，检测外源基因的瞬时表达。为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养养2448小时，让细胞倍增小时，让细胞倍增12代，使转染代，使转染DNA表达。表达。再按再按1：15比例转移到选择性培养基上，每比例转移到选择性

46、培养基上，每24天更换培天更换培养基，持续养基，持续23周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。骸，最后得到独立的克隆。在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要显性选择标记来分离转染细胞。因此需要显性选择标记来分离转染细胞。哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。选择剂选择剂基因基因使用浓度使用浓度氨甲喋呤氨甲喋呤dhfr0.01300 mol/L氨喋呤氨喋呤tk0.4 mol/L5-溴脱氧尿苷溴脱氧尿苷tk30 g/mlG

47、418,Zeocinneo100800 g/ml潮霉素潮霉素Bhyg10400 g/ml杀瘟稻菌素杀瘟稻菌素bsd210 g/ml霉酚酸霉酚酸gpt25 g/ml嘌呤霉素嘌呤霉素乙酰基转移酶乙酰基转移酶0.510 g/mlXyl-Aada4 mol/L报告基因报告基因特点特点使用与分析方法使用与分析方法cat内源活性低，蛋白稳内源活性低，蛋白稳定，线性范围窄，定，线性范围窄，体外，荧光或免疫分析体外，荧光或免疫分析 lacZ 有内源活性，有内源活性，X-gal染染色，线性范围宽色，线性范围宽体内外，染色，比色、体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析化学发光或荧光分析碱性磷酸碱性磷酸酶酶分泌型，

48、线性范围宽，分泌型，线性范围宽，受到细胞类型限制受到细胞类型限制体外，比色、化学发光体外，比色、化学发光或荧光分析或荧光分析gus蛋白质稳定，线性范蛋白质稳定，线性范围宽，围宽，X-Gluc染色染色体内外，染色，比色、体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析化学发光或荧光分析gfp无内源活性，分子量小，无内源活性，分子量小，稳定，无需底物，紫外线稳定，无需底物，紫外线激发激发体内外，荧光分析体内外，荧光分析第三节第三节 动物细胞培养的需求与培养基的制备动物细胞培养的需求与培养基的制备动物细胞离体后，失去了消化等系统，不能利用多糖、动物细胞离体后，失去了消化等系统，不能利用多糖、蛋白质等聚合程度高

49、的化合物。蛋白质等聚合程度高的化合物。只能利用简单的单体化合物如单糖、氨基酸等，为了只能利用简单的单体化合物如单糖、氨基酸等，为了维持细胞正常生长，还必须添加维生素、无机盐类、维持细胞正常生长，还必须添加维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等。其它附加成分等。动物细胞对培养环境的要求高，不同细胞系的要求也动物细胞对培养环境的要求高，不同细胞系的要求也不尽相同，培养基要尽可能与体内生活条件接近。不尽相同，培养基要尽可能与体内生活条件接近。一、动物细胞培养的营养需求一、动物细胞培养的营养需求1.糖类糖类 糖类是细

50、胞主要的营养物质，分解后释放出能量糖类是细胞主要的营养物质，分解后释放出能量ATP。培养基中都必须添加葡萄糖，有时添加核糖等。培养基中都必须添加葡萄糖，有时添加核糖等。提高细胞生长的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。提高细胞生长的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。2.氨基酸氨基酸氨基酸是蛋白质和酶的组成单位。氨基酸还参与合成一些氨基酸是蛋白质和酶的组成单位。氨基酸还参与合成一些含氮化合物，核苷酸的四种嘌呤和嘧啶碱基、儿茶酚胺等含氮化合物，核苷酸的四种嘌呤和嘧啶碱基、儿茶酚胺等含氮激素及神经递质等。氨基酸可通过生糖或生酮途径转含氮激素及神经递质等。氨基酸可通过生糖或生酮途径转变为糖或脂肪酸，