微生物学基本操作技术-课件.ppt

1、微生物学基本操作技术微生物基本操作技术微生物基本操作技术中国工业微生物菌种保藏管理中心中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术内内 容容n微生物分类微生物分类n微生物接种和培养微生物接种和培养n微生物的分离微生物的分离n微生物的鉴定微生物的鉴定n微生物保藏微生物保藏n质控微生物质控微生物医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术一、微生物分类一、微生物分类医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术一、微生物分类一、微生物分类-微生物的进化和多样性微生物

2、的进化和多样性普遍性系统发育树普遍性系统发育树,亲缘关系根据亲缘关系根据rRNA序列比较来决定。序列比较来决定。G.J.Olsen and C.R.Woese,Ribosomal RNA:A key to Phylogeny in the FASEB Journal,7:113-123,1993医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术一、微生物分类一、微生物分类n原核生物原核生物大小:0.5-3 mm形状:n-球型(Sthaphylococcus)n-棒状(Escherichia coli)n-螺旋(Rhodospirillum)生长迅速，20min至几小时

3、可繁殖一代可利用多种碳源 n真核生物真核生物细胞器：n线粒体n内质网n高尔基体n液泡医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术一、微生物分类一、微生物分类procaryote.jpg医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n原核生物原核生物一、微生物分类一、微生物分类医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n真核生物真核生物一、微生物分类一、微生物分类医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术一、微生物分类一、微生物分类-多相分类多相分类n表征（表型）特征

4、表征（表型）特征形态特征生理和代谢特征生态特征n遗传（基因型）特征遗传（基因型）特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列多相分类多相分类Polyphasic Texonomy Technology医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术一、微生物分类一、微生物分类-微生物的分类等级微生物的分类等级n“种种”是微生物分类中最基本的分是微生物分类中最基本的分类单元。类单元。n“种种”的定义：一个种（基因型的定义：一个种（基因型种）是有相似种）是有相似G+C组成并通过组成并通过DNA杂交试验判断由杂交试验判断由70%或更大或更大相似性的菌株的集合。相似性的菌株的集合。n

5、分类等级界（Domain）门（Phylum）纲（Class）目（Order）科（Family）属（Genus）种（Species）医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养q微生物接种定义微生物接种定义 将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种。移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种

6、。q接种工具接种工具 q微生物接种技术分类微生物接种技术分类斜面接种斜面接种液体接种液体接种穿刺接种穿刺接种平板接种平板接种 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养n斜面接种斜面接种左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环；右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环；用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上灼烧；焰上灼烧；接种环灼烧灭菌后插入试管内，

7、冷却、挑菌，转入另一斜面底部接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，沿斜面划曲线或直线。，沿斜面划曲线或直线。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养n液体接种液体接种操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；塞上棉塞，轻轻

8、摇动均匀；塞上棉塞，轻轻摇动均匀；如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术三、微生物接种和培养三、微生物接种和培养n穿刺接种穿刺接种用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部）用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出；，再沿原路拔出；此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。此法用于厌气性细菌接种，检查

9、细菌的运动能力。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二、微生物接种和培养二、微生物接种和培养n平板接种平板接种平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数等；等；n平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面；平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面；n斜面接平板：点种法、划线法。斜面接平板：点种法、划线法。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术二

10、、微生物接种和培养二、微生物接种和培养医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术三、微生物分离三、微生物分离医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术微生物纯培养分离技术微生物纯培养分离技术n纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。n获得纯培养物对微生物学研究至关重要。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术微生物纯培养分离技术微生物纯培养分离技术涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培养基分离法单细胞（孢子）分离法选择培养基分离法医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012

11、 微生物学基本操作技术涂布平板法涂布平板法1、少量样品加到平板中央（0.1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却；4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术涂布平板法涂布平板法样品需适当稀释样品需适当稀释30-300CFU/mL医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术平板划线法平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术平板划线法平板划线法斜线法：斜线法：用接种

12、环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。曲线法曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术平板划线法平板划线法血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术平板倾注法平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培

13、养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术稀释摇管法稀释摇管法n适合厌氧菌的纯培养分离无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右 梯度稀释后的待分离菌株加入试管中 摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物 培养后，菌落形成在琼脂柱的中间 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术液体培养基分离液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化

14、常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术单细胞（孢子）分离单细胞（孢子）分离单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术选择培养基分离选择培养基分离n选择培

15、养基特性促生长能力抑制能力指示（鉴别）能力医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术选择培养基分离选择培养基分离传统传统选择性培养基选择性培养基n血平板：血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。n营养肉汤：营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌n巧克力血平板：巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。n中国蓝平板或伊红美蓝平板：中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促进G-菌生长，是较好的弱选择性培养基。n麦康凯平板：麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。nSS琼脂：

16、琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。n碱性琼脂：碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术选择培养基分离选择培养基分离n新型显色培养基显色培养基利用微生物自身代谢产生的利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色酶与相应显色底物反应显色的原的原理来检测微生物的培养基。理来检测微生物的培养基。OrganismEnzyme Substrate Color Coliforms-galactosidaseX-GALBlue Escherichia coli-galactosidase-Glucuronida

17、se MUGfluorescenceEscherichia coli O157-galactosidaseX-GALBlue医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术选择培养基分离选择培养基分离医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术基于酶与底物反应的显色培养基技术基于酶与底物反应的显色培养基技术nCHROMagar医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术nPetrifilm 3MAerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform

18、 Count Plate E.coli/Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph.aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate 基于酶与底物反应的显色培养基技术基于酶与底物反应的显色培养基技术医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定n多相鉴

19、定（分类多相鉴定（分类)（polyphasic taxonomy）是利用微生物从）是利用微生物从分子特性分子特性到到生态特征生态特征的多种不同信息，综合的多种不同信息，综合表型表型和和基因型基因型特征进行微生物分类鉴定的方法。特征进行微生物分类鉴定的方法。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-形态学观察形态学观察细菌细菌酵母酵母丝状真菌丝状真菌宏观形态（培养特征）将培养物划线或稀释涂布，30培养1624小时，选取划线或稀释涂布分离得到单菌落，观察和记录菌落的形状、大小、质地、边缘、颜色、光泽、透明度、隆起等。将培养物划线接种于

20、葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固体培养基上，25培养23 d后，进行菌落形态观察，菌落质地、菌落颜色、菌落表面是否为反光或暗淡、菌落是平伏还是隆起、菌落边缘等。标准培养基（CA、CYA、WA）平板倒转，向上接种三点，每个菌株接种两个平板，倒置于 25温箱中进行培养7天。观察菌落直径、颜色、质地、渗出液、菌落反面颜色等特征。微观形态（细胞特征）将培养物在30条件下培养1624小时，挑取对数期的单菌落，涂布于事先滴加少量无菌水的载玻片上，自然干燥，加热固定，进行革兰氏染色，将制好的染色涂片在100X40倍的显微镜下观察革兰氏染色情况、菌体形状、排列行状、菌体大小等细胞特征。培养物划线接种于葡萄糖-酵母

21、提取物-蛋白胨固体培养基上，25培养23 d后，取酵母菌制作成水浸片，在显微镜下观察细胞形态和无性繁殖方式等。用无菌接种针挑取少量培养物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上，用接种针将菌丝团分散开，盖上盖玻片（勿使产生气泡），制成水浸片，显微镜下观察菌体形态特征，包括分生孢子梗、分生孢梗茎、顶囊、梗基、瓶梗、产孢结构、分生孢子头、分生孢子等。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术裂叶状波浪状圆锯齿状细圆锯齿状齿形锯齿状四、微生物鉴定四、微生物鉴定-形态学观察形态学观察医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微

22、生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性能源氧关系发酵产物最适pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化Division based on membrane composition:a)gram-negative have outer and inner membranes and a thin cell wall(Escherichia col

23、i)b)gram-positive have no outer membrane,but have a thicker cell wall(Bacillus subtilis)c)neither gram-nor gram+-no cell walls(mycoplasm)医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化nAPI(bioMerieux)(biochemical)医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-生理生化生理生化nBBL Crystal

24、(Becton Dickinson)n将传统的生化反应、酶底物呈色反应与荧光增强显色技术结合，设计鉴定反应最佳组合。n六类鉴定试验板，可鉴定500种细菌医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-化学成分分析化学成分分析min2.557.51012.51517.520pA131415161718 FID1 A,(E12619.602A0041080.D)1.748 2.032 2.110 3.638 4.066 7.066 8.578 8.720 10.226 10.851 11.529 11.696 11.952 12.116医疗

25、器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-基因型分析基因型分析nG+Cmol%n16S rDNA,26S rDNA D1/D2,5.8S rDNA ITS region,n-tubulin gene,calmodulin gene,gyrA gene,pheS gene,recN gene,rpoB gene and other housekeeping genes.nDNA Barcoding gene sequence analysis,MultiLocus Sequence Analysis(MLSA)nDNA-DNA hybr

26、idizationnRAPD,RFLP,AFLP,SSCP,Eric-PCR,BOX-PCR,Rep-PCR,LAMP.医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-基因型分析基因型分析DNA 指纹图谱分析指纹图谱分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCP ERICPCR 以细菌以细菌DNA中串联重复序列为引物，中串联重复序列为引物，通过扩增细菌通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，在不同种属个体间表现为在染色体基因组中广泛分布的短重复序列，在不同种属个体间表现为在染色体上存在的位置和拷贝数不同，以电泳条带比

27、较分析，揭示基因组间的上存在的位置和拷贝数不同，以电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异，应用于菌株分型。差异，应用于菌株分型。BOX-PCR根据根据BOX插入因子插入因子(大小为大小为 154 bp,由保守性不同的由保守性不同的 box A(57 bp)、box B(43 bp)和和 boxC(50 bp)等亚单位组成等亚单位组成)设计引物设计引物,扩增微生物基因扩增微生物基因组组DNA 的重复性片段的重复性片段,最最后经琼脂糖凝胶电泳检测后经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性。其多态性。REP-PCR 扩增细菌基因的重复扩增细菌基因的重复DNA 片段来获得菌株特异性遗片段来获得菌株特异性遗传图谱传图

28、谱,其中重复其中重复 DN A 片段包含了一个高度保守的回文序列片段包含了一个高度保守的回文序列(REP)为为 38 bp 的片段的片段,由由1个保守回文段以及两端分别有个保守回文段以及两端分别有6 个降解位点和个降解位点和1 个个5 bp 的可变框构成。的可变框构成。PCR-SSCP是聚合酶链式反是聚合酶链式反应与单链应与单链 DNA 非变性聚丙烯酰非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合，利用不同胺凝胶电泳技术结合，利用不同构象单链构象单链 DNA 在非变性聚丙烯在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速率的差异酰胺凝胶电泳中泳动速率的差异,检测出检测出DNA短片段中存在的单核短片段中存在的单核苷酸突变苷

29、酸突变,现已广泛应用于各种基现已广泛应用于各种基因多态性的研究。因多态性的研究。假丝酵母假丝酵母PCR-SSCP 副溶血弧菌副溶血弧菌ERICPCR 沙门氏菌沙门氏菌REP-PCR 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例116S rDNA序列系统发育树infB基因序列系统发育树医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术2007年年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表新种发表2008年年 ATCC 16404 鉴定为鉴定为 Aspergill

30、us brasiliensis sp.nov.2010年年 USP将将ATCC 16404 更名更名 2010年年 WDCM 将将ATCC 16404 更名更名 图：ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态anos Varga,Sandor Kocsube,Bea ta To th,et al.Aspergillus brasiliensis sp.nov.,a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution.International Journal of Systematic and E

31、volutionary Microbiology,2007,57:19251932图图:Rep-PCR条码系统发育树条码系统发育树(DiversiLab平台平台)Figure 2:Dendrogram of Rep-PCR Barcoding(DiversiLab Platform).注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis.Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter,2008,Vol.14(10):2-14表 ITSITS

32、序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequenceTable Difference of base position in ITS sequence四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术2007年年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表新种发表2008年年 ATCC 16404 鉴定为鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov.2010年年 USP将将ATCC 16404 更名更

33、名 2010年年 WDCM 将将ATCC 16404 更名更名 图图:基于曲霉黑色组基于曲霉黑色组-微管蛋白基因序列的微管蛋白基因序列的N-JN-J树树Figure:Neighbour joining tree based on-tubulin Figure:Neighbour joining tree based on-tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.sequence data of Aspergillus section Nigri.注：图片来源于Aspergillus brasiliensis sp.nov.,a bi

34、seriate black Aspergillus species with world-wide distribution International.Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2007,57:19251932图图1:1:基于基于ITS DNAITS DNA序列的黑色曲霉序列的黑色曲霉N-JN-J树树Figure 1:A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS Figure 1:A Neighbor Joining Tree of B

35、lack Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences.DNA Sequences.注：图片来源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis.Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter,2008,Vol.14(10):2-14四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n各种标准中仍将继续采用ATCC 16404作为质控

36、菌株。n各类标准中，其它被指定为参考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F)98003),需要重新复核鉴定。黑曲霉四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n形态学鉴定CYA培养基,25C培养7 dnBiologBiolog鉴定生长浊度试验nITS rDNAITS rDNA区序列分析ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3n-微管蛋白基因序列分析Bt2a:5-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3Bt2b:5-ACCCTCAG

37、TGTAGT GACCCTTGGC-3反应体系：反应体系：100 L,10 扩增缓冲液10 L;DNA模板1 L;dNTP(每种2.5 mmol/L)8 L;引物(10 L/L)各2.5 L;Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1.3 L;无菌超纯水补足总体积100 L。反应程序：反应程序：94C 5 min;94C 1 min,55C 1 min,72C 1 min,30个循环;72C 10 min,4C保存。四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n形态学鉴定图 2525C C培养7 d7 d菌种的宏观形

38、态和显微形态Fig Macromorphology and micromorphology on 25Fig Macromorphology and micromorphology on 25C,7 dC,7 d注:A菌落形态;B:分生孢子梗形态(100);C:分生孢子形态(400).Note:A:Colony morphology,B:Conidiophore morphology(100);C:Conidial morphology(400).该菌株的形态学特征符合黑曲霉A.niger的形态特征四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2

39、012 微生物学基本操作技术nBiolog鉴定注:没有生长;+:生长旺盛;w:微弱(边界)生长;v:可变.Note:No growth;+:Strong growth;w:Weak growth;v:Varied growth.表表 碳源利用情况碳源利用情况Table Carbon Source Utilization碳源Carbon sourceATCC16888Aspergillus nigerATCC16404Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003麦芽糖Maltose+-甲基-D-葡萄糖苷-Methyl-D-Glucoside+D-海藻糖D-Treha

40、lose+L-苹果酸L-Malic Acidv+-酮戊二酸-Ketoglutaric acidw苦杏仁苷Amygdalin+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术nITS rDNA区序列分析图 CMCC(F)98003CMCC(F)98003的ITS rDNAITS rDNA区序列和-微管蛋白基因序列PCRPCR扩增结果Fig ITS rDNA and-tubulin gene PCR Fig ITS rDNA and-tubulin gene PCR amplificati

41、on results of CMCC(F)98003amplification results of CMCC(F)98003注:M:DL2000 marker;1:ITS rDNA区PCR扩增结果;2:-微管蛋白基因PCR扩增结果.Note:M:DL2000 marker;1:ITS rDNA PCR amplification result;2:-tubulin gene PCR amplification result.表表 ITS序列特殊位点碱基差异序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequence碱基位点Base p

42、osition140166172173Aspergillus brasiliensis IMI 381727CCTCAspergillus niger ATCC 16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点.Note:The first C in the border sequence(TTACCG)of 18S and ITS1 is here defined as position 1.四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术nIT

43、S rDNA区序列分析以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中的第一个“C”为1位点。140140166166172172、173173四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术nITS rDNA区序列分析图 基于ITS区rDNA序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri.based on Their ITS DNA Sequences注:图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,图例为遗传距离

44、.Note:Numbers above branches are bootstrap values.Only values above 50%are indicated.Bar,genetic distance.CMCC(F)98003与与A.niger ATCC 16888聚类在分类距离最近的一个分支上,序列相似性达100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性也具有很高的相似性,序列同源性均在98.6%100%之间。四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n-微管蛋白基因序列分析图 基于-微管

45、蛋白基因序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig Neighbour-joining tree based on-tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri注:图中发育树节点只显示Bootstrap 值大于50%数值,图例为遗传距离.Note:Numbers above branches are bootstrap values.Only values above 50%are indicated.Bar,genetic distance.CMCC(F)98003与黑曲霉A.niger CBS554.65T序列同源性为100%。CMCC(

46、F)98003与黑色组的其他种序列同源性均在94.7%以下。n结合形态学、碳源利用情况和ITS rDNA序列系统发育分析等多相鉴定的结果,将CMCC(F)98003鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。四、微生物鉴定四、微生物鉴定-鉴定实例鉴定实例2医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术五、微生物保藏五、微生物保藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。n菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有

47、关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。中国微生物菌种保藏管理条例五、微生物保藏五、微生物保藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n制订专门菌种保藏管理制度；制订专门菌种保藏管理制度；n同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；n对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；藏设备中；n对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；n设专人负责管理菌种保藏设施正常运行

48、，定期检修维护。设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。五、微生物保藏五、微生物保藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n微生物菌种保藏方法基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。五、微生物保藏五、微生物保藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术常用菌种保藏方法常用菌种保藏方法n定期移植法定期移植法n液体石蜡法液体石蜡法n真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法n-80低温冻结法低温冻结法n液氮超低温冻结

49、法液氮超低温冻结法医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术定期移植法定期移植法n亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于面培养基上，最适条件下培养，完成培养于46进行保存并间隔一定时间（进行保存并间隔一定时间（3-63-6个月）进行移个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。植培养的一种短期菌种保藏方法。n操作步骤：操作步骤：斜面制备斜面制备 接种接种 培养培养 保藏保藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术v 斜面制备斜面制备培养基配制培

50、养基配制分分 装装灭灭 菌菌摆放斜面摆放斜面医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术v 接接 种种医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术n培养培养细菌细菌37 ，1-2d酵母酵母 2830，23d丝状真菌丝状真菌26，57dn保藏保藏46保藏保藏36个月个月v 培养和保藏培养和保藏医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物学基本操作技术定期移植法定期移植法v操作简单，使用方便；操作简单，使用方便；v对设备和人员要求不高；对设备和人员要求不高；v可随时使用，便于观察菌种；可随时使用，便于观察菌种；v工作