叶绿体基因工程的特点课件.ppt

1、叶绿体基因工程的特点1.前言2.叶绿体DNA简介3.叶绿体转化的步骤4.叶绿体转化较核转化的优越性5.绿体转化存在的问题6.叶绿体遗传转化的前景展望1.前言 1882年，Straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞；1909年，Baur和Correns通过在三种枝条颜色不同的紫茉莉之间进行杂交得出结论:质体是母本遗传的。这两项发现引起了人们对叶绿体遗传的研究兴趣。1988年，Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体（atpB基因突变体），使其完全恢复光合作用能力，标志着叶绿体基因工程的诞生；1990年，高等植物烟草的叶绿体转化获得成功，叶绿体转化的优势逐渐

2、被人们认识并利用。2.叶绿体DNA简介 叶绿体是绿色植物光合作用的场所，来源于古代的藻类原核生物，含有双链环状DNA（Manning,1971）叶绿体DNA有IRA和IRB两个反向重复序列（分别位于A链和B链），两者基因大小完全相同，只是方向相反，它们之间有一个大的单拷贝区（long single copy，LSC）大小约80Kb，和一个小的单拷贝区（short single copy，SSC），大小约20Kb。多数叶绿体DNA大小在120160Kb，最大2000Kb（伞藻），最小85Kb（刺海松）。叶绿体基因组中的基因在漫长的进化历程中，有许多转移到了核中，遗留在叶绿体中的基因是功能必需的一

3、些基因，有巨大的拷贝数（一个叶绿体中，基因拷贝数可达上百个；一个细胞中，基因的拷贝数可达上万个），而且它们都是原核生物来源的，具有原核生物基因的特点。叶绿体基因多为多顺反子转录单位，这些转录单位中基因的排列顺序是高度保守的。3.叶绿体转化的步骤3.1 将外源DNA导入叶绿体3.2 外源DNA整合进入叶绿体基因组3.3 筛选叶绿体转化的细胞3.4 再生稳定的转基因植株3.1 将外源DNA导入叶绿体 外源DNA穿过叶绿体的双层膜比穿过核膜要困难得多，叶绿体转化的一个关键问题是DNA进人细胞质后如何穿过叶绿体双层膜。目前最常用和最有效的方法是基因枪法，转化效率高且重复性好。此外还有农杆菌介导法、聚乙

4、二醇(PEG)介导法、显微注 射法等。3.2 外源DNA整合进入叶绿体基因组 用于叶绿体基因转化的质粒载体具有叶绿体基因组的同源片段、启动子及适于叶绿体表达的筛选标记，转化载体被载入叶绿体后通过与叶绿体基因组的同源片段之间发生两次同源重组，将外源基因整合到基因组特定位点。3.3 筛选叶绿体转化的细胞 高等植物中，每个叶绿体内又有数百个基因组拷贝，因此转化和未转化的叶绿体极易同时存在于转基因植株中，这种杂合体遗传不稳定。解决该问题的方法之一是在得到外源基因的转化子后，在增加选择压力的培养基上反复筛选，逐步淘汰野生型拷贝，最终使转基因植株中已整合外源基因的叶绿体基因组取代原基因组所有拷贝，即同质化

5、。3.4 再生稳定的转基因植株 目前常用的植物组织再生方式有愈伤组织再生和原生质体再生。转化外植体经脱分化培养诱导形成愈伤组织后，再通过分化培养诱导生根、发芽获得再生植株，将再生植株移栽土壤就可长成可育的成年植株。再生系统的遗传稳定性与再生方式、培养条件、外植体的选择等有关。4.叶绿体转化较核转化的优越性4.1 高效表达4.2 安全性好4.3 外源基因定点整合4.4 多顺反子形式表达基因4.5 易保持纯系4.6 可直接表达原核基因4.7 便于遗传操作4.1高效表达 叶绿体转化的最大优点是外源基因的高效表达。叶绿体基因在每个细胞中的数目高达500-10000拷贝，较核基因组可显著提高所转入外源基

6、因的拷贝数，从而使基因表达产物成倍增加;若在基因拷贝增加的同时使用叶绿体特异性表达的强启动子，则可大大提高外源基因的表达量。如Mcbride等将Bt毒素基因转人烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达量高达叶片总蛋白的3%-5%,而通常的核转化技术只能达到0.01%-0.6%。4.2 安全性好 转基因植物的安全性是基因工程中一个很重要的问题。绝大多数植物的叶绿体基因为母系遗传，外源基因整合进叶绿体基因组后不会扩散，因此不会发生核基因工程那样因花粉传递而可能造成的“基因逃逸”问题。4.3 外源基因定点整合 核转化中外源基因的插入是随机的，产生“位置效应”。这要求大量筛选以找到需要的转化植株，而且随机插入很

7、难控制，可能引起转基因失活，使转化后的表型不能真正反映外源基因的功能。而叶绿体的基因在不同物种中是高度保守的，可以利用同源整合将外源基因定点插入到两个基因之间，并不影响叶绿体原有基因的表达。外源基因在叶绿体的定点整合已在烟草、拟南芥和马铃薯中获得成功。4.4 多顺反子形式表达基因 叶绿体中功能相似的基因常存在于同一操纵子中并同时表达，所以外源基因也可以多顺反子的形式转化叶绿体并正常表达，避免了核基因工程中多基因转化时常出现的基因沉默现象，有利于标记基因、目的基因及功能相关基因的共同转化，也使一次转化中形成整条代谢途径成为可能。4.5 易保持纯系 叶绿体是母系遗传，所以一旦得到纯合而稳定的叶绿体

8、转化体，这种纯系的种子后代将永远保持为纯系，不会因为有性杂交发生分离。4.6 可直接表达原核基因 叶绿体基因组无组蛋白，其大多数基因的排列方式、转录与翻译系统均与原核生物类似，因此来自原核生物的外源基因无需改造和修饰就可在叶绿体高效表达，这是核基因转化无法做到的。4.7 便于遗传操作 叶绿体基因组小，结构简单，不与组蛋白结合，使遗传操作易于进行。烟草、水稻、玉米等高等植物的叶绿体基因组全序列已被测定，遗传背景较清楚，这更有利于对叶绿体进行转化。5.绿体转化存在的问题 5.1 叶绿体转化的同质化问题 5.2 植物的种类有待扩展 5.3 选择标记基因 5.4 缺乏表达的组织发育专一性5.1 叶绿体

9、转化的同质化问题 由于高等植物的每个细胞中有10100个叶绿体,每个叶绿体内有10100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。5.2 植物的种类有待扩展 可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。5.3

10、 选择标记基因 烟草叶绿体遗传转化所用的十分有效的选择标记基因是抗壮观霉素(aadA)基因,而高等植物核转化表明这种选择标记基因对部分具抗生素耐性的双子叶植物和单子叶植物选择效率低,无法得到大量转化植株。因此有效的选择标记基因是实现扩大叶绿体遗传转化植物种类的关键因素。最近,利用绿色荧光蛋白(GFP)和氨基糖苷磷酸转移酶作为筛选标记的研究已取得一定的进展。5.4 缺乏表达的组织发育专一性 叶绿体基因组的启动子中除了光调控启动子具有组织专一性外,一般都没有组织专一性,特别是发育专一性表达的特性,而对于转基因植物来说,为了保障不影响细胞正常代谢,提高细胞内物质能量的有效利用率,常要求外源基因能够具

11、有可调控的组织或时间上的特异性表达,表达调控元件的选择对外源基因的高效表达至关重要。6.叶绿体遗传转化的前景展望 6.1 促进理论研究 6.2 提高光合效率，增加农作物产量 6.3 研制生物反应器 6.4 提高植物杭性 6.5 提高蔬菜营养价值6.1 促进理论研究 解决叶绿体基因表达调控机制、核质基因的相互作用、光合作用的机理、叶绿体基因的。6.2 提高光合效率，增加农作物产量 利用叶绿体基因工程还实现了对光合作用关键酶Rubisco的操纵，Whitney SM等用Rhodospiridium rubrum(红冬孢酵母属)的B f Rubisco取代了烟草Rubisco大亚基编码基因rbcl，

12、从而创造了第一株有生存能力且Rubisco特性得到改造的植物，将更高效的Rubisco转入植物叶绿体有望提高光合作用效率，从而增加农作物产量。6.3 研制生物反应器 由于叶绿体可高效表达外源基因，故可能成为工业用酶或药用蛋白如生长因子、干扰素、抗体、疫苗等产品的生物反应器。2000年Sturb等以叶绿体作为生物反应器生产出具生物活性的人类生长激素蛋白，表达量比核系统高300倍。2001年Ruf将外源基因转到番茄叶绿体中，在果实特化叶绿体有色体内大量表达，在果实中得到了较高的外源蛋白。生产可口服的疫苗、抗体等开辟了道路。2002年张景煌等将聚3-羚基丁酸醋合成相关基因导入了烟草叶绿体中，为生产新

13、型生物可降解塑料提供了可行途径。6.4 提高植物杭性 目前抗性育种基因工程所用的外源基因大多来自原核生物，多年来采用的核基因技术需对这些基因修饰或重新合成，耗费大量财力但收效不大，且易出现“基因逃逸”。而采用叶绿体转化技术时外源基因无需改造且超量表达，是农作物抗性育种的一条新途径。抗除草基(EPSPS)、抗病原体蛋白基因(MS1-99)、抗虫基因(Cry)、耐盐基因(tps1,BADH)均已实现了在叶绿体中的高效表达。6.5 提高蔬菜营养价值 叶绿体是许多代谢反应的发生场所，参与氨基酸、脂肪酸和淀粉等物质的生物合成。对这些代谢反应的关键酶基因进行改造，或者直接导入外源蛋白基因，可望在蔬菜叶子中大幅度提高人类必需氨基酸、脂肪酸、糖类与蛋白质含量。7.结语 叶绿 体 基 因工程是一门年轻的技术，虽然前景诱人，但还存在一些难以解决的问题。目前已成功转化的植物种类少，在已转化的几种植物中也只有烟草和番茄能通过有性生殖使外源基因稳定遗传，人类的主要作物都未实现真正的叶绿体转化。随着叶绿体基因表达、调控机制研究的日益深入和叶绿体转化技术的不断完善，叶绿体基因工程必将为遗传工程带来新的生机和活力。