原核表达课件.ppt

1、 原核表达（七天速成）原核表达（七天速成）南京农业大学南京农业大学 于岩飞于岩飞 李权李权 20132013年年9 9月月1最先学习原核表达的重要性首先首先：实验室主要是核酸实验和蛋白实验，原核表达是核酸和蛋白实验的基础，涵盖了很多基本实验操作，是新生熟悉实验室基本实验流程和操作的最佳入手实验。包括PCR、接菌、转化、连接、酶切、提质粒、胶回收和纯化蛋白等许多最基本的实验。其次其次：我们实验室主要是做比较基因组学和比较蛋白组学的研究，原核表达是我们实验研究的基础，我们会经常表达蛋白，所以原核表达就显得尤其重要，原核表达还是缺失的基础，后面我们会做缺失实验。再者再者：原核表达出来的蛋白是很多实验

2、的基础，可以做ELISA、疫苗、检测免疫原性等等。2transcriptiontranslationreplication亚单位疫苗的研究免疫原性检测毒力因子研究ELISA实验与细胞受体相互作用机理的研究原核表达蛋白的用途原核表达蛋白的用途3原核表达流程大纲v（一）引物设计v（二）获得目的基因（0.5天）v（三）构建重组表达载体(0.5天)v（四）获得含重组表达质粒的表达菌种（4天）v（五）诱导表达、蛋白纯化与跑胶（2天）4根据目的片段序列设计引物目的片段和质粒胶回收PCR目的片段胶回收目的片段和质粒分别双酶切目的片段和质粒进行连接 连接产物导入DH5转化提质粒测序，双酶切鉴定挑单菌落，Amp

3、LB试管摇浑PCR鉴定选取阳性AmpLB试管扩大培养将质粒导入BL21转化涂AmpLB平板IPTG诱导表达纯化出目的蛋白涂AmpLB平板挑单菌落，AmpLB试管摇浑PCR鉴定，双酶切鉴定选取阳性AmpLB试管扩大培养原核表达流程图5（一）引物设计（一）引物设计鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer）ompA 实例分析6引物（引物（表达引物表达引物）设计原则）设计原则1.1.目的片段一般为一个完整的阅读框，起始密码子：目的片段一般为一个完整的阅读框，起始密码子：AUGAUG，GUG,UUGGUG,UUG开始，终止密码子开始，终止密码子UAAUAA,UAG,UGA,UAG,

4、UGA结束。结束。片段长度为片段长度为3 3的倍数，不能移码的倍数，不能移码2.2.引物长度一般在引物长度一般在15-3015-30个碱基之间个碱基之间3.3.引物引物GCGC含量在含量在40%-60%40%-60%之间，之间，TmTm值最好接近值最好接近72 72 Tm=4 Tm=4（G+CG+C）+2+2（A+TA+T）4.4.引物引物33端不能选择端不能选择A A，最好选择，最好选择T T 5.5.碱基要随机分布碱基要随机分布 76.6.引物自身及引物之间引物自身及引物之间不应存在互补序列不应存在互补序列 7.7.引物引物5 5 端和中间端和中间G G值应该相对较高，而值应该相对较高，而

5、3 3 端端G G值较低值较低 8.8.引物的引物的55端可以修饰，而端可以修饰，而33端不可修饰端不可修饰 9.9.扩增产物的单链不能形成二级结构扩增产物的单链不能形成二级结构 10.10.引物应具有引物应具有特异性特异性 引物设计原则引物设计原则8常用引物设计软件常用引物设计软件vPremier Primer 5.0vOligo 6.0vVector NTI SuitvDnasisvOmigavDnastar9Premier Primer 5.0Premier Primer 5.0主要功能:1.自动搜索2.引物设计3.限制性内切酶位点分析4.DNA 基元(motif)查找5.同源性分析10

6、Oligo 6.0Oligo 6.01.功能较Premier Primer 5.0更为单一，主要是引物设计及引物评价2.常与Premier Primer 5.0联合使用进行原核表达所用引物的设计11 登录NCBI：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/1213共，共，按照把各位数字按照把各位数字相加，除以得相加，除以得整数，即可认为整数，即可认为这一序列能编码这一序列能编码完整的氨基酸序完整的氨基酸序列列14将基因序列复制粘贴到 软件内并保存15将DNA Sequence 翻译成氨基酸序列Control+A 选中DNA Sequence,点击“Goodies”“Translat

7、e DNA”16查看有无信号肽（Signal Peptide）SignalP 3.0 Server:http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/171819打开Oligo 6.0202122点击“”“Current oligo length”232425点击“”“”2627点击“”“”“”28下拉滚动条，下一方块中的数值要求同上同样的操作查看”False Priming Sites”选项中“Lower Primer”的各项数值是否合适29点击“Edit”“Upper Primer Alt+U”和“Lower Primer Alt+L”30查找酶切位点打开Prim

8、er Premier “File”“New”“New DNA Squence”31323334353637引物信息保存方式下下38（二）获得目的基因v1.加ddH O溶解引物，稍微离心。v2.以新鲜菌液为模板，50ul体系PCR。v3.PCR产物跑电泳，胶回收（试剂盒），测浓度。Mix 25ul Up-primer 2ulLow-primer 2ul模板 4ulddH O 17ul程序94 5min94 30sTm 30s72 t(1000bp1min)72 10min16 保存30-35循环39（三）构建重组表达载体v1.目的片段和质粒分别双酶切。BamH1最适温度是30，其他酶一般为37。

9、E1 1ulE2 1ul10 xbuffer 2ul目的基因 1ug V 1ugx1000/浓度（ng/ul）ddH O 补足20ul40v2.胶回收酶切产物，测浓度。v3.连接酶切后目的片段和质粒，16过夜。T4 DNA Ligase 1ul10 x T4 DNA Ligase buffer 2.5u目的片段 【长度（bp）x0.3x0.66/浓度】x2质粒 【长度（bp）x0.03x0.66/浓度】x2ddH O 补足25ul41（四）获得含重组表达质粒的表达菌种v1.转化 将重组质粒导入DH5。（1）将 DH5（BL21 同理）冰上融化，5ul/10ul连接产物+50ul/100ul D

10、H5,冰浴30min。（2）42热激90，冰浴2min30s。（3）超净台加1mlLB，37 100rpm 50min-1h。（4）4000rpm离心2min，弃上清，余约100ul重悬。（5）涂LB Amp+平板，37过夜。v2.挑单菌落于EP管，PCR鉴定，阳性者接菌于试管扩大培养。42v3.阳性菌提重组质粒（试剂盒），测序和双酶切鉴定，完全正确后冻存。v4.将重组质粒转化到BL21。v5.挑单菌落于EP管，PCR鉴定，阳性者接菌于试管扩大培养。v6.阳性菌提重组质粒，双酶切鉴定，正确后冻存。43（五）诱导表达、蛋白纯化与跑胶v1.含有重组质粒2mlBL21+200mlLB+200ulAm

11、p+v2.37，180rpm摇2.5-3h，OD值大约0.4-0.6，加IPTG，然后再37 摇5h左右。v3.用50ml离心管4 8000rpm离心10min,弃上清。v4.用适量PBS重悬，离心，PBS再重悬，离心，上清溶解buffer重悬。v5.超声破碎，200W左右，100-300次。v6.4 8000rpm离心10min。44v7.上清倒入干净的50ml离心管中，2mlPBS重悬包涵体。v8.16ul上清+4ul的5xSDS loading buffer 16ul包涵体+4ul的5xSDS loading bufferv9.煮沸10min,跑蛋白胶确定表达蛋白是在上清还是在包涵体。4

12、5若蛋白在包涵体中v1.将PBS（4ml）重悬的沉淀分装在两个2mlEP管中，12000rpm，15min。v2.弃上清，每管用1.5ml 8M包涵体溶解buffer重悬。v3.30水溶60min，期间经常震荡。v4.12000rpm，15min，收集上清弃沉淀。v5.将含有蛋白的上清用0.45um滤器过滤。v6.用10ml包涵体洗脱buffer过柱。v7.用5ml20%乙醇过柱。46v8.用5ml的蒸馏水过柱。v9.用5ml的包涵体溶解buffer 1ml/min过柱。v10.将滤好的蛋白液过柱（尽量慢），收集滤出液。v11.用10ml的包涵体溶解buffer 1ml/min过柱，收集滤出液

13、。v12.用5ml包涵体洗脱buffer洗柱，收集滤出液。（标号，每管1ml）v13.用10ml的包涵体溶解buffer 1ml/min过柱。v14.用5ml20%乙醇过柱。47若蛋白在上清中v1.将含有蛋白的上清用0.45um滤器过滤。v2.用10ml上清洗脱buffer过柱。v3.用5ml20%乙醇过柱。v4.用5ml的蒸馏水过柱。v5.用5ml的上清溶解buffer 1ml/min过柱。v6.将滤好的蛋白液过柱（尽量慢），收集滤出液。v7.用10ml的上清溶解buffer 1ml/min过柱，收集滤出液。48v8.用5ml上清洗脱buffer洗柱，收集滤出液。（标号，每管1ml）v9.用10ml的上清溶解buffer 1ml/min过柱。v10.用5ml20%乙醇过柱。所有过柱液体都要用0.22um滤器过滤。所有过柱蛋白都要用0.45um滤器过滤。注意注意4950