免疫印迹-课件.ppt

1、Western blot 蛋白质免疫印记蛋白质免疫印记1ppt课件生物大分子印迹法始创于生物大分子印迹法始创于19751975年，内苏格兰爱年，内苏格兰爱丁堡大学丁堡大学E.M.SouthernE.M.Southern首先提出。他将限制酶首先提出。他将限制酶切后的切后的DNADNA片段先进行琼脂糖凝胶电泳，把一片段先进行琼脂糖凝胶电泳，把一张硝酸纤维素纸放在凝胶上，利用毛细作用原张硝酸纤维素纸放在凝胶上，利用毛细作用原位凝胶中的位凝胶中的DNADNA片段转移到硝酸纤维素纸上使片段转移到硝酸纤维素纸上使之固定化。由于这种技术类似用吸干作品上的之固定化。由于这种技术类似用吸干作品上的墨迹，使吸墨纸

2、染上墨迹而被称为印迹法墨迹，使吸墨纸染上墨迹而被称为印迹法(Blotting)(Blotting)。关于印迹法2ppt课件19791979年，年，TowbinTowbin等人利用电洗脱装置作为印迹等人利用电洗脱装置作为印迹动力，首先把动力，首先把WesternblotWesternblot法用于抗原捡出，法用于抗原捡出，并称之为免疫印迹法并称之为免疫印迹法(Immunoblotting)(Immunoblotting)。对。对应于应于Southern(DNASouthern(DNA分子杂交分子杂交)、Northern(RNANorthern(RNA分子杂交分子杂交)。19811981年，年，B

3、urnetteBurnette把免疫印迹法称为把免疫印迹法称为Western Western blottingblotting即蛋白质印迹法即蛋白质印迹法-Westernblot-Westernblot法。法。关于印迹法3ppt课件 主要内容4ppt课件Western blotWestern blot的中文名称是：蛋白质印迹的中文名称是：蛋白质印迹,也叫免疫印迹也叫免疫印迹（immunoblotting)immunoblotting)。是分子生物学中常用的三种印迹技。是分子生物学中常用的三种印迹技术之一。目前公认的该实验技术的发明人为美国斯坦福大术之一。目前公认的该实验技术的发明人为美国斯坦福

4、大学的乔治学的乔治斯塔克（斯塔克（George StarkGeorge Stark）。）。WestWestern blotern blot蛋白质蛋白质印迹印迹Southern blotDNASouthern blotDNA印迹印迹Northern blotRNANorthern blotRNA印迹印迹Western Blot 简介5ppt课件Western Blot 简介Western BlotWestern Blot的程序是对经处理的样本（血清、的程序是对经处理的样本（血清、培养细胞和组织匀浆）先进行培养细胞和组织匀浆）先进行 SDS-SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳(SDS-P

5、AGE)(SDS-PAGE)，以分离蛋白质。然后将电，以分离蛋白质。然后将电泳分离开的蛋白质转移至具有结合力的印迹膜上。泳分离开的蛋白质转移至具有结合力的印迹膜上。对印迹膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性对印迹膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。最后对膜上蛋白质进行检验。吸附。最后对膜上蛋白质进行检验。6ppt课件关于Western Blot 利用抗原抗体反应来测定标本中抗原或抗体的方利用抗原抗体反应来测定标本中抗原或抗体的方法称为免疫测定法称为免疫测定(Immunoassay)(Immunoassay)检测对象：具有免疫活性的物质检测对象：具有免疫活性的物质反应特性：高度的特异性和敏

6、感性反应特性：高度的特异性和敏感性7ppt课件 主要内容8ppt课件Western blot基本原理在电场的作用下，蛋白样品通过在电场的作用下，蛋白样品通过SDS-PAGESDS-PAGE按分子量大小分离，再转移按分子量大小分离，再转移到一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。到一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。9ppt课件Western blot 优点优点高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原特异敏感的抗原-抗体反应抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白10ppt课件Western blot 缺点抗体交叉反应引发的非特异性条带抗体交叉反应引发的非

7、特异性条带额外的二抗孵育额外的二抗孵育11ppt课件Western blot应用目的蛋白的表达量（定量）分析目的蛋白的表达量（定量）分析目的蛋白的表达特性（定性）分析目的蛋白的表达特性（定性）分析目的蛋白的组织定位目的蛋白的组织定位目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白与其它蛋白的互作12ppt课件实验流程13ppt课件实验成功要素蛋白分离蛋白分离蛋白抽提，蛋白定量，蛋白电泳蛋白抽提，蛋白定量，蛋白电泳转膜转膜杂交膜的选择与处理，转膜条件的优化杂交膜的选择与处理，转膜条件的优化封闭封闭封闭液的选择，封闭条件的优化封闭液的选择，封闭条件的优化洗涤洗涤洗涤液的配制，洗涤时间及次数的选择洗涤液的配制，洗涤

8、时间及次数的选择抗体孵育抗体孵育抗体的选择，抗体稀释倍数的优化抗体的选择，抗体稀释倍数的优化底物孵育底物孵育发光或显色底物的选择发光或显色底物的选择发光或显色发光或显色曝光或显色时间的控制，显影定影试剂的选择曝光或显色时间的控制，显影定影试剂的选择后期操作后期操作抗体剥离缓冲液（蛋白印迹膜再生液）抗体剥离缓冲液（蛋白印迹膜再生液）14ppt课件仪器与设备低温超速离心机低温超速离心机分光光度计分光光度计电泳仪电泳仪 垂直式电泳槽垂直式电泳槽 电转系统电转系统15ppt课件垂直式电泳槽垂直式电泳槽16ppt课件17ppt课件电转系统电转系统18ppt课件电转仪19ppt课件 主要内容20ppt课件

9、6.6.最后加上相应的最后加上相应的底物溶液，当二抗底物溶液，当二抗上的酶催化底物产上的酶催化底物产生化学发光时生化学发光时,用用X X光片曝光，洗片后光片曝光，洗片后就会产生可见的区就会产生可见的区带，指示目的蛋白带，指示目的蛋白质的位置和强弱。质的位置和强弱。3.3.通过通过SDS-PAGE电电泳将蛋白样品分开。泳将蛋白样品分开。5.5.印迹首先用封闭液处理印迹首先用封闭液处理以封闭固相载体上剩余的以封闭固相载体上剩余的疏水结合位点，而后用目疏水结合位点，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印迹中只有目的蛋孵育，印迹中只有目的蛋白质与一抗特异性结合。白质与一抗特异性结

10、合。洗去游离的一抗后，用再洗去游离的一抗后，用再与酶标记的二抗孵育与酶标记的二抗孵育4.4.将电泳分离的蛋白将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固从凝胶转移至一种固相支持体相支持体.转移后的膜转移后的膜就称为一个印迹就称为一个印迹（blot），用于对蛋），用于对蛋白质的进一步检测。白质的进一步检测。1.1.样品前处样品前处理，理，提取细提取细胞或组织蛋胞或组织蛋白白2.2.测定蛋白浓度，测定蛋白浓度，样品变性样品变性21ppt课件一、蛋白样品的提取提取细胞蛋白多是将细胞裂解、破碎、将蛋白提取细胞蛋白多是将细胞裂解、破碎、将蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很多。一般质释放的原理。提取蛋白质的方法很

11、多。一般要考虑后续实验对蛋白性质的不同要求，而采要考虑后续实验对蛋白性质的不同要求，而采用不同的裂解方法。用不同的裂解方法。22ppt课件水溶液提取法制备总蛋白水溶液提取法制备总蛋白稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性强、溶解度高，是提取蛋白质最常用的溶剂，但要考虑不同物种或类型的组织或细胞。常用的中性盐是硫酸铵。常用的组织或细胞裂解液有RIPA、SDS、NP-40、Triton。还有商品化试剂盒可供选择。一、蛋白样品的提取23ppt课件例：例：RIPA裂解液（中度）配方：裂解液（中度）配方：1 M Tris-HCl(pH7.4)2 ml3 M NaCl(MW:58.5)2 mlNP400.4

12、ml0.5 M EDTA0.04 ml5%脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠4 ml18兆去离子水调整总体积兆去离子水调整总体积40ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)150mM NaCl 1%NP40 0.5%脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)0.5 mM EDTA每每10ml RIPA裂解液放入裂解液放入0.1ml蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂cocktail.-20分装保存，临用前无需加入分装保存，临用前无需加入PMSF。24ppt课件有机溶剂提取法制备总蛋白有机溶剂提取法制备总蛋白溶液中的有机溶剂使蛋白质分子间极性基团的静电引力增溶液中的有机溶剂使蛋白质分子间极性基团

13、的静电引力增强，导致水化作用降低，蛋白质易聚集而沉淀出来。强，导致水化作用降低，蛋白质易聚集而沉淀出来。有机溶剂适用于分子中非极性侧链较多蛋白质的提取，包有机溶剂适用于分子中非极性侧链较多蛋白质的提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白样品的提取25ppt课件层析、色谱或电洗脱方法制备靶蛋白层析、色谱或电洗脱方法制备靶蛋白靶蛋白分布或定位靶蛋白分布或定位裂解液裂解液备注备注细胞质（可溶蛋白）细胞质（可溶蛋白）NP-40 or RIPANP-40 or RIPASDSSDS作用最强，裂解细胞完全，基作用最强，裂解细胞完全，基本使蛋白变性失活，而本使蛋白变性失活，而NP-40N

14、P-40较温较温和，和，Triton X-100Triton X-100介于两者之间。介于两者之间。三者均为去垢剂，若非必要尽量不选三者均为去垢剂，若非必要尽量不选择择SDSSDS。细胞质（不溶蛋白）细胞质（不溶蛋白）Tris-TritonTris-Triton细胞质（磷酸化蛋白）细胞质（磷酸化蛋白）NP-40NP-40细胞膜细胞膜NP-40 or RIPANP-40 or RIPA若若IPIP时发现背景过高，即非特异蛋时发现背景过高，即非特异蛋白也被白也被IPIP下来，则需要选用裂解强下来，则需要选用裂解强度较高的度较高的RIPARIPA（强或中）；若目的（强或中）；若目的蛋白无法被蛋白无法

15、被IPIP下来，则可以使用较下来，则可以使用较为温和的为温和的RIPARIPA（弱）或（弱）或NP-40NP-40。细胞核细胞核RIPARIPA细胞核（转录因子）细胞核（转录因子）NP-40NP-40线粒体线粒体RIPARIPA一、蛋白样品的提取26ppt课件一、蛋白样品的提取裂解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质裂解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质：1.1.表达靶蛋白的细菌一般直接用表达靶蛋白的细菌一般直接用SDSSDS凝胶加样缓冲液裂解。凝胶加样缓冲液裂解。2.2.酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。取液。3.3.哺乳动物

16、组织通常可以机械分散并直接溶于哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDSSDS凝胶加凝胶加样缓冲液。样缓冲液。4.4.哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在相应抽提过程，也可在SDSSDS凝胶加样缓冲液裂解。凝胶加样缓冲液裂解。27ppt课件细胞准备细胞准备用用PBSPBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，吸入胞，吸入1.5ml1.5ml离心管。由于染色体离心管。由于染色体DNADNA的释放，溶液变得的释放，溶液变得很粘稠。很粘稠。超声打碎染色体超声打碎染色体D

17、NADNA，直至溶液不粘为止。，直至溶液不粘为止。44，13000rpm13000rpm，3030分钟离心。分成三层：上层为油脂，分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。中层为蛋白质，下层为沉淀。有必要时重复上一步骤。有必要时重复上一步骤。上清用于做上清用于做SDS-PAGESDS-PAGE，如不能立即做，可将上清转入另一，如不能立即做，可将上清转入另一离心管离心管-80-80保存。保存。一、蛋白样品的提取28ppt课件一、蛋白样品的提取注意事项注意事项细胞裂解液的量细胞裂解液的量超声的频率、时间、次数。插得深不起泡沫。超声的频率、时间、次数。插得深不起泡沫。检测蛋白的敏感性

18、检测蛋白的敏感性1 15ng,1.5mm5ng,1.5mm厚的厚的SDSSDSPAGEPAGE的一个孔的一个孔大约上大约上200ug200ug的总蛋白。的总蛋白。只要被检测蛋白占总蛋白的只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,1/100000,即可被检测。即可被检测。未知蛋白应同时作阳性对照。未知蛋白应同时作阳性对照。29ppt课件 不论采用那种方法，都应遵循以下原则：不论采用那种方法，都应遵循以下原则：1 1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。失。2 2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的

19、降解，低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。的种类很多，要根据具体情况具体选择。3 3样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80-80。切勿反复冻融已制备好的样品。切勿反复冻融已制备好的样品。目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求实验的需求一、蛋白样品的提取30ppt课件二、蛋白样品的定量n Western blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各

20、组之间总蛋白量基本一致尽量使各组之间总蛋白量基本一致;n 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定;蛋白质含蛋白质含量太高则会使带形扭曲量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力。甚至会影响此电泳方法的分辨力。n目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考法（考马斯亮蓝法）、马斯亮蓝法）、Lowry法（法（Folin-酚试剂法）、酚试剂法）、BCA法等。法等。31ppt课件BradfordBradford法法 其原理为：蛋白质与染料考马斯亮蓝其原理为：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250G-250结合，使得染

21、结合，使得染料最大吸收峰从料最大吸收峰从465nm465nm变为变为595nm595nm，在一定的线性范围内，在一定的线性范围内，反应液反应液595nm595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定定595nm595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。处吸光度的增加即可进行蛋白定量。二、蛋白样品的定量32ppt课件LowryLowry法法 其原理为：蛋白质与碱性铜溶液中的其原理为：蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+Cu2+络合使得肽链伸络合使得肽链伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林酚试剂

22、反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的林酚试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。定时需使用同种蛋白质作标准。二、蛋白样品的定量33ppt课件BCABCA法法 是是LowryLowry测定法的一种改进方法。与测定法的一种改进方法。与LowryLowry方法相比，方法相比，BCABCA法的法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏操作更简单，试剂

23、更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到度更高（微量检测可达到0.5g/ml0.5g/ml），应用更加灵活。其原），应用更加灵活。其原理为：蛋白质分子中的肽链在碱性条件下能与理为：蛋白质分子中的肽链在碱性条件下能与Cu2+Cu2+络合生成络络合生成络合物，同时将合物，同时将Cu2+Cu2+还原成还原成Cu+Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+Cu+结合生成深紫色的结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在化合物，这种稳定的化合物在562nm562nm处具有强吸收值，并且化处具

24、有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。定蛋白质的含量。二、蛋白样品的定量34ppt课件BCABCA法蛋白浓度测定法蛋白浓度测定 试剂：试剂：BCABCA工作液工作液 ，双蒸水，蛋白标准液（，双蒸水，蛋白标准液（将将2mg/ml2mg/ml蛋白蛋白溶液稀释至溶液稀释至2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml,2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.25mg/ml,0.125mg/ml,0.0625mg/ml0.125mg/ml,0.0625mg/ml。）。）管

25、号管号012345蛋白标准蛋白标准液液1001005050252512.512.56.6.25253.1253.125ddH2O0 05050757587.587.593.593.596.896.8样品样品101010101010101010101010BCA(ML)BCA(ML)2 22 22 22 22 22 2x axis00.10.20.30.40.50.60.70.80.9100.20.40.60.81Graph#1Linear Fit:y=A+Bx:ABR2Plot#1(Group01:Concentration vs Values)0.03341.010.997二、蛋白样品的定量

26、二、蛋白样品的定量35ppt课件BradfordBradford法敏感度高，并且与一系列干扰法敏感度高，并且与一系列干扰LowryLowry、BCABCA法的还原剂（如法的还原剂（如DTTDTT、巯基乙醇）相容。、巯基乙醇）相容。与与BradfordBradford法相比，法相比，BCABCA法的显著优点是不受常法的显著优点是不受常用浓度去垢剂的影响。用浓度去垢剂的影响。与与LowryLowry法相比，法相比，BCABCA法操作更简单且稳定性更好，法操作更简单且稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度最高（可低至几乎没有干扰物质的影响，灵敏度最高（可低至 0.5g/ml0.5g/ml）。）。

27、二、蛋白样品的定量二、蛋白样品的定量36ppt课件二、蛋白样品的定量三种方法对于去污剂依然是敏感的，其最主要三种方法对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，并且无可比性。差异较大，并且无可比性。BradfordBradford法法BCABCA法法试管法试管法100-1500g/ml100-1500g/ml20-2000g/ml20-2000g/ml微孔法微孔法1-25g/ml1-25g/ml0.5-10g/ml0.5-10g/ml37ppt课件2 2SDS-PAGESDS-PAGE上样缓冲液：上样缓冲液：DTTD

28、TT可临用前以可临用前以1 1：4 4比例混合加入，亦可全部配好分装，比例混合加入，亦可全部配好分装，-2020冻存。冻存。按按1:11:1比例与蛋白质样品混合，比例与蛋白质样品混合，9595100100加热加热5 515min15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l20-25l，总蛋白量，总蛋白量202050g50g。1M Tris-HCl (pH6.8)1M Tris-HCl (pH6.8)10 ml10 ml1M DTT1M DTT20 ml20 mlSDSSDS4 g4 g甘油甘油20 ml20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g0.2 g总体积总体

29、积100ml100ml 100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰溴酚兰 20%甘油甘油 ddH2O38ppt课件SDSSDS：阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDSSDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋与强还原剂一起使蛋白分子

30、氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。白质分子线性化。39ppt课件蛋白质-SDS胶束的特点：（1 1）具有相同的形状，形状）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒像一个长椭圆棒（2 2）平均）平均1g 1g 蛋白质结合蛋白质结合1.4g SDS1.4g SDS（3 3）短轴对不同的蛋白质亚）短轴对不同的蛋白质亚基基-SDS-SDS胶束基本上是相同的胶束基本上是相同的（4 4）长轴的长度则与亚基分）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比子量的大小成正比40ppt课件蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束所带的负电荷远超过蛋白质原有胶束所带的负电荷远超过蛋白质原有的净电荷，消除了不同分子之间所带净电荷的差的

31、净电荷，消除了不同分子之间所带净电荷的差异。异。蛋白质的电泳迁移率主要取决于亚基的相对分子蛋白质的电泳迁移率主要取决于亚基的相对分子量。量。41ppt课件原理：原理：SDSSDS是一种离子性的表面活性剂，它有强离子性的是一种离子性的表面活性剂，它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。当硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。当SDSSDS与蛋白质混合与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质时，它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来，而以硫酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白包起来，而以硫酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和质和SDSSDS的平均结合量是的平

32、均结合量是1:1.4(1:1.4(以重量为单位以重量为单位)，而蛋白质，而蛋白质结合固定比例的结合固定比例的SDSSDS之后，由于之后，由于SDSSDS带强负价，使蛋白质原带强负价，使蛋白质原先的带电价微不足道，且每单位重量之蛋白质带电价一致先的带电价微不足道，且每单位重量之蛋白质带电价一致(charge density)(charge density)，所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩，所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。下分子大小一项因素。四、四、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳42ppt课件四、四、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺

33、凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)(polyacrylamide gel)是由单体丙烯是由单体丙烯酰胺酰胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称Acr)Acr)和交联剂和交联剂(crosslinker)(crosslinker)N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺(N,N-(N,N-ethylenebisacylamideethylenebisacylamide，简称，简称Bis)Bis)在催化剂和加速剂在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明

34、度。是良好的电泳性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。介质。43ppt课件聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（AcrAcr）；）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（BisBis）；）；催化剂：过硫酸胺或核黄素（催化剂：过硫酸胺或核黄素（APAP）；）；加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）；产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free(free radicals)radicals)的催化，使体系发生

35、氧化还原作用的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-(catalyst-redox systems)redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化来完成的。催化体系主要有化学催化（APAPTEMEDTEMED）和光化学催化（核黄素）和光化学催化（核黄素TMTEDTMTED）体系。）体系。四、四、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳44ppt课件PAGEPAGE分为连续系统和不连续系统两大类。分为连续系统和不连续系统两大类。不连续系统不仅有电荷效应、分子筛效应，还具不连续系统不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带的清晰度及分辨率有浓缩效应，

36、因而其分离条带的清晰度及分辨率均较高。均较高。作用作用缓冲液缓冲液pHpH凝胶浓度凝胶浓度浓缩胶浓缩胶 使蛋白样品浓缩使蛋白样品浓缩 pH6.8 Tris-HClpH6.8 Tris-HCl低，低，2-5%2-5%分离胶分离胶 使蛋白样品分离使蛋白样品分离 pH8.8 Tris-HClpH8.8 Tris-HCl高，高，6-20%6-20%四、四、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳45ppt课件分离胶浓度分离胶浓度蛋白线性分离范围蛋白线性分离范围20%4-40kDa15%10-43kDa12%12-60kDa10%20-80kDa8%36-94kDa6%57-212kDa46pp

37、t课件蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束在大孔径浓缩胶中的迁移速度相胶束在大孔径浓缩胶中的迁移速度相对快；在小孔径分离胶（分子筛）中的迁移速度对快；在小孔径分离胶（分子筛）中的迁移速度慢。慢。凝胶中的缓冲对为凝胶中的缓冲对为Tris-HClTris-HCl，缓冲液的缓冲对为，缓冲液的缓冲对为Tris-GlyTris-Gly。浓缩胶中的离子迁移速度为浓缩胶中的离子迁移速度为Cl-Cl-（快离子）（快离子）蛋白蛋白质质GlyGly离子（慢离子）。离子（慢离子）。47ppt课件蛋白质在快、慢离子间形成的界面处，被浓缩成蛋白质在快、慢离子间形成的界面处，被浓缩成一狭窄的中间层。当泳动至两层凝胶的交界处时

38、，一狭窄的中间层。当泳动至两层凝胶的交界处时，由于凝胶孔径的不连续性使蛋白质迁移受阻而压由于凝胶孔径的不连续性使蛋白质迁移受阻而压缩成很窄的区带。缩成很窄的区带。进入分离胶后，进入分离胶后，GlyGly离子的迁移率超过蛋白质，离子的迁移率超过蛋白质，留在后面的蛋白质被分离成多个区带。留在后面的蛋白质被分离成多个区带。48ppt课件SDS-PAGESDS-PAGE的注意事项：的注意事项：低电压低电压10-20V10-20V预电泳预电泳20-30min20-30min可清除凝胶中的杂可清除凝胶中的杂质，以保证电泳通道畅通。质，以保证电泳通道畅通。低电压可使分离胶的分子筛效应得以充分发挥，低电压可使

39、分离胶的分子筛效应得以充分发挥，电泳条带更趋精致。电泳条带更趋精致。应在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液以避免应在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液以避免边缘效应。边缘效应。49ppt课件50ppt课件灌胶 灌制分离胶 隔绝空气51ppt课件灌制浓缩胶灌制浓缩胶 插入梳子插入梳子 52ppt课件电泳 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品（璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品（MarkerMarker：5-10 5-10 l l；样本：；样本：1 10 0 l l）。将加样器针头插至加样孔中

40、缓慢加入样品。（加样太快可使）。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3 3次，以免交叉污染。次，以免交叉污染。采用恒压的方法：采用恒压的方法：1.1.恒压恒压6 60V0V，至样本跑过，至样本跑过 浓缩胶；浓缩胶；2.2.将电压调至将电压调至120V120V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行进行转膜。至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行进行转膜。Staking gelSeparating gel53

41、ppt课件54ppt课件五、转膜凝胶电泳结束后，将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电凝胶电泳结束后，将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，常用的固相支持物有泳方式转印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC NC（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及PVDFPVDF（聚偏氟乙烯）膜。（聚偏氟乙烯）膜。选择膜的主要根据有：选择膜的主要根据有：1.1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量）结合蛋白的载量）2.2.膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）3.3.不影响后续的显

42、色检测（也就是适合用于所选显色方法，不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法，信噪比好）信噪比好）4.4.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜55ppt课件56ppt课件湿转系统湿转系统转一张膜需准备滤纸和转一张膜需准备滤纸和1 1张转印膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因张转印膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。转膜前，转印膜以及滤纸均需浸润在电转为手上的蛋白会污染膜。转膜前，转印膜以及滤纸均需浸润在电转液中活化液中活化15-20m

43、in15-20min（其中（其中PVDFPVDF膜需在无水甲醇中活化膜需在无水甲醇中活化3 30min0min后再浸润后再浸润于电转液中，且滤纸应与胶和膜的大小一致）。于电转液中，且滤纸应与胶和膜的大小一致）。将玻板轻轻撬开，将凝胶剪裁后从玻板上移至电转液中。从阴极到将玻板轻轻撬开，将凝胶剪裁后从玻板上移至电转液中。从阴极到正极，按照三层滤纸正极，按照三层滤纸 凝胶凝胶 转印膜转印膜 三层滤纸的顺序制成三层滤纸的顺序制成“三三明治明治”（湿转在三明治的两侧各加一层活化过的海绵，同时应注意（湿转在三明治的两侧各加一层活化过的海绵，同时应注意去除膜、凝胶和滤纸之间的气泡）。去除膜、凝胶和滤纸之间的

44、气泡）。57ppt课件-滤纸滤纸凝胶凝胶膜膜滤纸滤纸+58ppt课件半干转移系统59ppt课件转膜前的注意事项用镊子小心夹膜，避免用手直接接触，手上的蛋白和油脂会用镊子小心夹膜，避免用手直接接触，手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并弄脏膜。影响转膜效率并弄脏膜。转膜前先将海绵、凝胶、膜用预冷的转移缓冲液浸泡，否则转膜前先将海绵、凝胶、膜用预冷的转移缓冲液浸泡，否则凝胶会在转膜过程中出现皱缩，导致转移条带变形。凝胶会在转膜过程中出现皱缩，导致转移条带变形。膜和滤纸的大小与凝胶一致，过大和过小均会影响转膜效率膜和滤纸的大小与凝胶一致，过大和过小均会影响转膜效率凝胶、膜和滤纸之间无气泡存在，否则会导致转

45、膜不完全。凝胶、膜和滤纸之间无气泡存在，否则会导致转膜不完全。转膜过程会产生大量的热，必须在冰浴或者转膜过程会产生大量的热，必须在冰浴或者44中进行。中进行。具体转膜时间要根据靶蛋白大小而定，原则上分子量越大转具体转膜时间要根据靶蛋白大小而定，原则上分子量越大转膜时间越长，反之则短。膜时间越长，反之则短。60ppt课件观察膜上的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的两条带较观察膜上的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的两条带较难全部转移。难全部转移。转完后将膜用转完后将膜用1 1丽春红染液染丽春红染液染5min5min（于脱色摇床上摇）。然后用（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就

46、可看到膜上的蛋白，将膜晾干备用。水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白，将膜晾干备用。将凝胶用考马斯亮蓝染色，观察凝胶中的蛋白是否完全转至印迹将凝胶用考马斯亮蓝染色，观察凝胶中的蛋白是否完全转至印迹膜上。膜上。61ppt课件SubstrateProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentMembranePrimary AntibodySecondaryAntibody/Enzyme(E)sssssssssProductPPPPP七、封闭，结合一抗，结合二抗62ppt课件为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特为避免作为检测

47、试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。合位点进行封闭处理。封闭剂应该封闭膜上所有未结合位点来降低抗体的非封闭剂应该封闭膜上所有未结合位点来降低抗体的非特异性结合。特异性结合。不替换膜上的靶蛋白不替换膜上的靶蛋白不结合靶蛋白的抗原表位不结合靶蛋白的抗原表位不与抗体或检测试剂有交叉反应不与抗体或检测试剂有交叉反应膜于封闭液中室温轻摇孵育膜于封闭液中室温轻摇孵育1-4h1-4h，也可，也可44过夜。过夜。63ppt课件常用的封闭剂：64ppt课件结合一抗、二抗结合一抗、二抗把膜放在密闭塑料袋或者

48、培养皿中，根据膜面积以把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm0.1mL/cm2 2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育育1-21-2小时或小时或44过夜。过夜。回收一抗溶液，用回收一抗溶液，用TBSTTBST漂洗膜漂洗膜3 3次，每次次，每次10min10min。加入二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育加入二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-21-2小时或小时或44过过夜。夜。用用TBSTTBST漂洗膜漂洗膜3 3次，每次次，每次10min10min。最后用最后用TBSTBS漂洗膜漂洗膜2 2次，每次次，每次10min10mi

49、n。65ppt课件抗体选择一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合作为探针性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合作为探针用于用于WETERN-BLOTWETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是彻底变性的。，因为这一实验中靶蛋白是彻底变性的。多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可能预言用对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可能预言用特定多克隆抗血清来

50、测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。表位的效果。设置对照：设置对照：1.1.不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗体）不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗体）2.2.样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合物选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合物 为佳。为佳。66ppt课件一抗孵育一抗孵育按说明书用封闭液稀释一抗，一般推荐稀释倍数为按说明书用封闭液稀释一抗，一般推荐稀释倍数为