亲合组织化学技术-课件.ppt

1、第五章 亲合组织化学技术1ppt课件发展历史6060年代：发现生物素和卵白素年代：发现生物素和卵白素7070年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A A蛋白蛋白-BRAB-BRAB、LABLAB、SPA-HRPSPA-HRP、ABCABC亲和组织化学：亲和组织化学：19761976年年BayerBayer首次提出首次提出 包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌A A蛋蛋白与白与IgGIgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等用部位和受体等2p

2、pt课件植物凝集素植物凝集素(Lectin)(Lectin)生物素生物素(Biotin)(Biotin)葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白蛋白(SPA)(SPA)SPASPAHRPHRP法、法、ABCABC法和法和LABLAB法等。法等。亲合组织化学技术亲合组织化学技术定义：定义：是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，建立的组织细胞基础化学技术。础，建立的组织细胞基础化学技术。本质：本质：区别于一般的组织化学，非抗原抗体反应。区别于一般的组织化学，非抗原抗体反应。优点：优点：敏感性高，有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚敏感性高，有利于微量抗原（或抗

3、体）在细胞或亚细胞水平的定位。细胞水平的定位。3ppt课件一一 抗生物素抗生物素生物素免疫细胞化学技术生物素免疫细胞化学技术 二二 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A技术技术 三三 凝集素组织化学技术凝集素组织化学技术四四 其它亲和细胞化学其它亲和细胞化学4ppt课件一、抗生物素生物素免疫细胞化学技术 (一一)基本原理基本原理 亲合素（抗生物素亲合素（抗生物素/卵白素）卵白素）是鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白，属于糖蛋白是鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白，属于糖蛋白;具有具有4 4个同维生素个同维生素H(H(生物素生物素)亲合力极高的结合点。亲合力极高的结合点。链酶亲合素链酶亲合素 是一种从链酶菌培养物中提

4、取的蛋白质，和亲合素一样，也有四个生物素结是一种从链酶菌培养物中提取的蛋白质，和亲合素一样，也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。生物素（维生素生物素（维生素H H）是一种小分子的水溶性维生素，它与亲合素链酶亲合素之间有很强的亲合是一种小分子的水溶性维生素，它与亲合素链酶亲合素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100100万倍，能够彼此牢固结合而不影响万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。彼此的生物学活性。生物素、亲合素、链酶亲合素：生物素、亲合素、链酶亲合素：能与荧光素、铁蛋

5、白和过氧化酶等相结合。能与荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合。亲合素、链酶亲合素：亲合素、链酶亲合素：同一定浓度的生物素化酶混合后，形成亲合素一生物同一定浓度的生物素化酶混合后，形成亲合素一生物素一酶复合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。素一酶复合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。5ppt课件（二）几种亲合素生物素染色技术 1 1 亲合素一生物素亲合素一生物素过氧化物酶复合物技术过氧化物酶复合物技术(ABC)(ABC)2 2链酶亲合素链酶亲合素-生物素生物素-过氧化物酶复合物技术过氧化物酶复合物技术(SABC(SABC法法)3 3标记生物素标记生物素抗生物素技术抗生物素技术(

6、LAB)(LAB)4.SP/SAP4.SP/SAP法法5.Envision5.Envision法法6.CSA6.CSA法法6ppt课件ABCABC复合物：复合物：复合物复合物1 1 亲合素一生物素亲合素一生物素过氧化物酶复合物技术过氧化物酶复合物技术(ABC)(ABC)7ppt课件 基本原理基本原理 是将亲合素作为是将亲合素作为“桥桥”与生物素化的抗体与生物素结合的酶与生物素化的抗体与生物素结合的酶（HRP)HRP)连接起来。连接起来。第一抗体：第一抗体：为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原；为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原；第二抗体：第二抗体：为为生物素化的桥抗体生物素化的桥抗体

7、，能与第一抗体结合；，能与第一抗体结合；第三抗体：第三抗体：是结合了过氧化物酶的亲合素复合物是结合了过氧化物酶的亲合素复合物(即即ABCABC)。优点：优点：敏感性强（比敏感性强（比PAP高高20-40倍）；倍）；特异性强，背景染色淡；特异性强，背景染色淡；方法简便，节约时间方法简便，节约时间（比（比PAPPAP缩短缩短2h2h）；由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。用于双重或多重免疫染色。8ppt课件 操作步骤操作步骤 冰冻切片或石蜡切片均可。冰冻切片或石蜡切片均可。冰冻切片：丙酮固定，冰冻切片：丙酮固定

8、，PBS PBS 洗洗5min5min，更换，更换3 3次。次。石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。第一抗体第一抗体孵育，过夜。孵育，过夜。PBS PBS洗洗5min5min，更换，更换3 3次。次。加加生物素标记的第二抗体生物素标记的第二抗体，孵育，孵育15min15min。PBS PBS洗洗5min5min，更换，更换3 3次。次。加加ABCABC复合物复合物室温作用室温作用15min15min。PBS PBS洗洗5min5min，更换，更换3 3次。次。用用DABDAB显色。显色。复染、封片、观察。复染、封片、观察。结果结果 呈棕黄色为阳性表达，核被苏木精染成浅蓝

9、色。呈棕黄色为阳性表达，核被苏木精染成浅蓝色。9ppt课件(4)注意事项 消除内源性生物素：消除内源性生物素：染色前以染色前以0.010.01的亲合素和的亲合素和0.010.01生物素溶生物素溶液分别作用液分别作用20min20min以消除内源性生物素活性，每次作用后用以消除内源性生物素活性，每次作用后用PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min5min。消除内源性过氧化物酶：消除内源性过氧化物酶：可用可用3 3 H H2 2O O2 2孵育孵育5-105-10分钟以灭活内源分钟以灭活内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗性过氧化物酶活性。蒸馏水洗3 3次。次。试剂的保存：试剂的保存：温度以温度以44

10、为佳，可达为佳，可达2 2年之久，在年之久，在2020时其生物时其生物活性反而在短期内被破坏。活性反而在短期内被破坏。此外，生物素制剂之间相互亲和性差异大，注意厂家和批号。此外，生物素制剂之间相互亲和性差异大，注意厂家和批号。10ppt课件SABC法原理：原理：一抗生物素化二抗一抗生物素化二抗SABCSABC复合物复合物SABCSABC复合物复合物 生物素标记的二抗生物素标记的二抗链霉卵白素连接链霉卵白素连接 生物素标记的酶。生物素标记的酶。优点：优点：敏感性略高于敏感性略高于SPSP法，低背景和操法，低背景和操作简便作简便缺点：缺点：因体内含有内源性生物素，易产因体内含有内源性生物素，易产生

11、非特异性染色。生非特异性染色。一抗一抗+生物素标记二抗生物素标记二抗+滴加试剂滴加试剂SABCSABC（链霉卵白素（链霉卵白素+辣根酶标记生物素辣根酶标记生物素)+)+辣根酶底物显色辣根酶底物显色2 链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法)11ppt课件SABCSABC试剂盒试剂盒(含正常血清，生物素化二抗，含正常血清，生物素化二抗，SABCSABC等等)操作程序操作程序1 1）载玻片防脱处理：可选择）载玻片防脱处理：可选择APESAPES或或PolyPolyLysineLysine，烤片。，烤片。2 2）切片常规脱蜡至水。）切片常规脱蜡至水。3 3）3 3H H2 20 02

12、2 灭活内源性酶。蒸馏水洗灭活内源性酶。蒸馏水洗3 3次。次。4 4）抗原热修复：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液）抗原热修复：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)(PH6.0)，电炉或，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔微波炉加热至沸腾后断电，间隔5 51010分钟后，反复分钟后，反复1 12 2次。次。冷却后冷却后PBSPBS洗涤。洗涤。5 5）滴加）滴加5 5BSABSA封闭液，室温封闭液，室温2020分钟。甩去多余液体，不洗。分钟。甩去多余液体，不洗。6 6）滴加适当稀释的）滴加适当稀释的一抗一抗，371371小时左右或小时左右或202202小时左右。小时左右。也可也可44过夜。过夜。PBS

13、(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗2 2分钟分钟3 3次。次。对照切片用对照切片用PBSPBS代替一抗。代替一抗。12ppt课件7 7）滴加）滴加生物素化二抗生物素化二抗，202037203720分钟。分钟。PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗2 2分钟分钟3 3次。次。8 8）滴加试剂）滴加试剂SABCSABC，202037203720分钟。分钟。PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗5 5分钟分钟4 4次。次。9 9）DABDAB显色：使用显色：使用DABDAB显色试剂盒。取显色试剂盒。取1ml1ml蒸馏水，加试剂盒蒸馏水，加试剂盒中中

14、A A、B B、C C试剂各试剂各1 1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在控制反应时间，一般在5 5一一3030分钟之间。蒸馏水洗涤。分钟之间。蒸馏水洗涤。1010）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。结果结果 棕褐色为阳性结果，而细胞核染为淡蓝色。棕褐色为阳性结果，而细胞核染为淡蓝色。13ppt课件 注意事项注意事项 1 1）染色背景过高：）染色背景过高：在在SABCSABC反应之后，反应之后，DABDAB显色之前，用加有显色之前，用加有0.0l0.0l一一0.020.02TWEE

15、N20TWEEN20的的PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗涤切片洗涤切片4 4次，单纯次，单纯PBSPBS洗洗2 2次，次，然后然后DABDAB显色。显色。2 2）抗原热修复：）抗原热修复：可选可选0.01M0.01M枸橼酸盐缓冲液；枸橼酸盐缓冲液；也可以使用也可以使用PBSPBS、TBSTBS等多种缓冲液。等多种缓冲液。14ppt课件3 标记生物素抗生物素技术(LAB)原理：原理：第第抗体：抗体：生物素标记；生物素标记；第二抗体：第二抗体：酶标记抗生物素酶标记抗生物素(亲合素亲合素)操作步骤：操作步骤：切片中加入切片中加入生物素标记一抗生物素标记一抗，室温孵育，室温孵育1

16、 h1 h，。，。0.01MPBS 0.01MPBS洗洗3 3次，每次次，每次5 min5 min。20-50ug 20-50ugml ml HRP-HRP-抗生物素抗生物素液孵育。液孵育。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。DAB DAB显色。蒸馏水漂洗。显色。蒸馏水漂洗。苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。应用不如应用不如ABCABC普遍，但手续较简便，但灵敏度低。普遍，但手续较简便，但灵敏度低。15ppt课件SP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）原理：原理：一抗生物素化二抗酶标记的

17、链一抗生物素化二抗酶标记的链霉卵白素霉卵白素优点：优点：高灵敏度、低背景、操作方高灵敏度、低背景、操作方便便缺点：缺点：不适用于内源性生物素丰富不适用于内源性生物素丰富的组织的组织16ppt课件三步法（以三步法（以SPSP试剂盒为例）试剂盒为例）石蜡切片脱蜡至水。石蜡切片脱蜡至水。蒸馏水冲洗，蒸馏水冲洗，PBSPBS浸泡浸泡5 5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。3%H 3%H2 2O O2 2室温孵育室温孵育5-105-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBSPBS冲洗，冲洗，2 2分钟分钟3 3次。次。

18、5-10%5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育正常山羊血清封闭，室温孵育1010分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比 例 稀 释 的比 例 稀 释 的 一 抗一 抗 或 一 抗 工 作 液，或 一 抗 工 作 液，3 7 3 7 孵 育孵 育 1-21-2 小 时 或小 时 或 4 4 过 夜。过 夜。PBS PBS冲洗，冲洗，2 2分钟分钟3 3次。次。滴加适当比例稀释的滴加适当比例稀释的生物素标记二抗生物素标记二抗（1%BSA-PBS1%BSA-PBS稀释），稀释），3737孵育孵育10-10-3030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，分钟；或滴加第二代生物

19、素标记二抗工作液，3737或室温孵育或室温孵育10-2010-20分钟。分钟。PBS PBS冲洗，冲洗，2 2分钟分钟3 3次。次。滴加适当比例稀释的滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素辣根酶标记链霉卵白素（PBSPBS稀释），稀释），3737孵育孵育10-10-3030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，3737或室温孵育或室温孵育10-2010-20分钟。分钟。PBS PBS冲洗，冲洗，2 2分钟分钟3 3次。次。显色剂显色（显色剂显色（DABDAB或或AECAEC）。）。自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。自来水充分冲洗，复染

20、，脱水透明（如需要）、封片。17ppt课件原理：原理：将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体架联接成一个多聚体 优点：优点：1 1 简便、快速、敏感性是简便、快速、敏感性是SPSP、SABCSABC法的几十倍。法的几十倍。2 2 人体组织中不含有这种多聚物，人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了组织中生物素的干扰从而避免了组织中生物素的干扰缺点：缺点：因大分子穿透核膜困难因大分子穿透核膜困难,对于核内抗原的定位不能选用此法。对于核内抗原的定位不能选用此法。Envision法法一抗一抗+二抗标记多聚螯合物酶二抗标记多聚螯合物酶Envision法18ppt课

21、件EnVisionEnVision工作程序：工作程序：1 1）脱蜡、水化组织切片。脱蜡、水化组织切片。2 2）预 处 理 组 织 切 片（据 一 抗 具 体 说 明 而 定）预 处 理 组 织 切 片（据 一 抗 具 体 说 明 而 定）3 3）蒸馏水漂洗，置于蒸馏水漂洗，置于PBSPBS中。中。4 4）阻 断 内 源 性 过 氧 化 物 酶（仅 用 于阻 断 内 源 性 过 氧 化 物 酶（仅 用 于 E n V i s i o n T M/H R PE n V i s i o n T M/H R P）5 5）蒸馏水漂洗，置于蒸馏水漂洗，置于PBSPBS，1010分钟分钟6 6）一抗一抗孵育

22、孵育10-3010-30分钟分钟7 7）PBSPBS漂洗漂洗1010分钟分钟8 8）EnVisionEnVisionTMTM孵育孵育10-3010-30分钟分钟9 9）PBSPBS漂洗漂洗1010分钟分钟10)10)色源底物溶液孵育色源底物溶液孵育1010分钟分钟11)11)蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗12)12)复染及封片复染及封片19ppt课件CSA法（催化信号放大法）原理：原理：是酪胺的过氧化物酶反应是酪胺的过氧化物酶反应(即即HRP催化酪胺催化酪胺盐，形成共价键结合位点盐，形成共价键结合位点)，产生大量的酶，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括包括

23、色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样结合，这样在抗原在抗原抗体结合部位就有大量的生物素沉抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的链霉亲和素积，与随后加入的链霉亲和素HRP结合，结合，如经几次这样的循环放大，可以网络许许多如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过多的酶分子，最后通过DAB的显色反应，的显色反应，其敏感性得到几何级放大。其敏感性得到几何级放大。优点：优点：比比EnVision法敏感法敏感20100倍。倍。适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量检测以

24、及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法较少的组织细胞抗原的检测方法;核内抗原的检测（原为杂交）。核内抗原的检测（原为杂交）。缺点：缺点：操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源性干扰，背景染色有时较重。性干扰，背景染色有时较重。20ppt课件二、葡萄球菌蛋白A技术 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)A(SPA)：金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，作为桥抗体或标记抗体金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，作为桥抗体或标记抗体不受种属特异性的限制，它能和人及许多动物不受种属特异性的限制，它能和人及许多动物IgGIgG结合，对结合，对IgGIgG免疫球蛋

25、白亚型的结合有选择性。免疫球蛋白亚型的结合有选择性。葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)A(SPA)技术原理：技术原理：结合部位是结合部位是FcFc段，不影响抗体的活性；段，不影响抗体的活性；结合力是双价的，可同时结合两个结合力是双价的，可同时结合两个IgGIgG分子；分子；可将酶、荧光素、胶体金等标记在可将酶、荧光素、胶体金等标记在SPASPA上。上。21ppt课件 SPA应用:1 免疫球蛋白的制备和分析能和IgG及其某些Fc段结合，可提纯、分析免疫球蛋白制剂。2 应用于免疫细胞化学结合力是双价的，可作为桥抗体或标记抗体。且不受种属特异性限制；分子量小，穿透力强。3 应用于多种细菌、支原体和

26、病毒的简易快速诊断SPA菌体为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集素，用于细菌、病毒的定群和分型。4 可作为固相吸附剂研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig 22ppt课件SPA在免疫细胞化学染色中的应用SPASPA可被荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等标记，其中最常用可被荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等标记，其中最常用的酶为的酶为HRPHRP1 SPA-HRP1 SPA-HRP用于间接法的染色用于间接法的染色 (1)(1)切片脱蜡至水，切片脱蜡至水，3 3H H2 2O O2 2抑制内源性过氧化物酶活性。抑制内源性过氧化物酶活性。(2)(2)水洗后，水洗后，PBSPBS漂洗。漂洗。(3)(3

27、)加加一抗一抗，3737孵育孵育60min60min或或44过夜。过夜。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。(4(4)SPA-HRP)SPA-HRP室温室温30min30min。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。(5)DAB(5)DAB显色。显色。(6)(6)苏木精复染，脱水，透明，封固。苏木精复染，脱水，透明，封固。23ppt课件2 SPA2 SPA用于用于PAPPAP法的染色法的染色 (1)(1)切片脱蜡至水，切片脱蜡至水，0.30.3H H2 20 02 2甲醇处理切片。甲醇处理切片。(2)10(2)10卵蛋白卵蛋白TrisTris缓冲液处理

28、缓冲液处理20min20min。(3)(3)加加第一抗体第一抗体3737孵育孵育60min60min或或44过夜。过夜。(4)0.05M Tris-HCl(4)0.05M Tris-HCl，pH7.6pH7.6，洗涤，洗涤3 3次。次。(5)(5)SPASPA(1ug(1ugm1)m1)孵育孵育15min15min，0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl溶液漂洗溶液漂洗3 3次。次。(6)(6)PAPPAP复合物复合物(无动物种属限制无动物种属限制)孵育孵育15min15min。0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl溶液漂洗溶液漂洗3 3次。（次。（抗酶抗体

29、抗酶抗体 +足量的酶足量的酶 =形成稳定的五角形复合物）形成稳定的五角形复合物）(7)DAB(7)DAB显色。显色。(8)(8)苏木精复染，脱水，透明，封固。苏木精复染，脱水，透明，封固。24ppt课件三、凝集素组织化学技术凝集素凝集素(1ectin)(1ectin)：从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，能凝集红细胞。的蛋白，能凝集红细胞。常用：常用：刀豆素刀豆素(ConA)(ConA)、麦胚素、麦胚素(WGA)(WGA)、花生凝集素、花生凝集素(PNA)(PNA)、大豆凝集素大豆凝集素(SBA)(SBA)等等凝集

30、素特性：凝集素特性：凝集素具有多价结合的能力，能识别糖蛋白和糖肽，特别是细凝集素具有多价结合的能力，能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中碳水化合物胞膜中碳水化合物抗原决定簇抗原决定簇，结合力为一专一性能，能与荧，结合力为一专一性能，能与荧光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等示踪物示踪物结合，从而在结合，从而在光镜、电镜水平显示其结合部位。因此凝集素可作为一种光镜、电镜水平显示其结合部位。因此凝集素可作为一种探针探针来研究细胞膜上特定的糖基结构。来研究细胞膜上特定的糖基结构。25ppt课件凝集素受体是存在于细胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖，而凝集素受体是存在于细胞膜上

31、的糖蛋白和糖脂中的寡糖，而这种受体可区别细胞的类型和反映细胞在分化、成熟和在肿这种受体可区别细胞的类型和反映细胞在分化、成熟和在肿瘤细胞中的作用。瘤细胞中的作用。1 1 作为细胞分化成熟的标记作为细胞分化成熟的标记血细胞，特别是淋巴细胞的分群血细胞，特别是淋巴细胞的分群2 2 作为细胞特殊类型的标记作为细胞特殊类型的标记人视网膜人视网膜 视锥细胞（视锥细胞（PNA+PNA+）视杆细胞（）视杆细胞（PNA-PNA-）乳腺乳腺 乳腺上皮细胞（乳腺上皮细胞（PNA+PNA+）肌上皮细胞和间质细胞（）肌上皮细胞和间质细胞（PNA-PNA-）3 3 在肿瘤中凝集素结合的改变在肿瘤中凝集素结合的改变 PH

32、APHA胃癌诊断性标志胃癌诊断性标志应用：应用：26ppt课件凝集素在免疫细胞化学中的应用方法：1 1 直接法直接法 将标记物直接标记在凝集素上，与相应糖蛋白或糖脂结合。将标记物直接标记在凝集素上，与相应糖蛋白或糖脂结合。(1)(1)操作步骤操作步骤 1)1)切片脱蜡至水切片脱蜡至水(或恒冷箱切片，冷丙酮固定，室温干燥或恒冷箱切片，冷丙酮固定，室温干燥)。2)32)3H H2 2O O2 2甲醇液阻断内源性过氧化物酶甲醇液阻断内源性过氧化物酶101015min15min。3)3)过氧化物酶标记的花生凝集素过氧化物酶标记的花生凝集素，室温，室温30-60min30-60min。4)0.01M P

33、BS4)0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。5)DAB5)DAB显色。显色。6)6)常规脱水、透明、封固。常规脱水、透明、封固。(2)(2)结果结果 阳性部位呈棕褐色阳性部位呈棕褐色27ppt课件 2 2 间接法间接法 细胞膜上的相应糖基细胞膜上的相应糖基+凝集素凝集素+标记的抗凝集素抗体标记的抗凝集素抗体操作步骤操作步骤：(1)(1)切片常规脱蜡至水。切片常规脱蜡至水。(2)3(2)3H H2 20 02 2甲醇液阻断内源性过氧化物酶甲醇液阻断内源性过氧化物酶101015min15min。(3)(3)凝集素凝集素稀释液孵育稀释液孵育60min60min。(4)0.01M PBS(4)0.

34、01M PBS漂洗漂洗3 3次，每次次，每次3min3min。(5)(5)适当稀释的适当稀释的标记的抗凝集素抗体标记的抗凝集素抗体孵育孵育30min30min。(6)0.01M PBS(6)0.01M PBS漂洗漂洗3 3次，每次次，每次3min3min。(7)DAB(7)DAB显色。显色。(8)(8)苏木精复染，脱水，透明，封固。苏木精复染，脱水，透明，封固。间接法较直接法敏感性高，但必须购买抗凝集素抗体间接法较直接法敏感性高，但必须购买抗凝集素抗体。28ppt课件(2)(2)操作步骤操作步骤 1)1)切片脱蜡入水，流水洗切片脱蜡入水，流水洗5min5min。2)2)用用PBSPBS配制的小

35、鼠肝粉抑制组织内源性生物素。配制的小鼠肝粉抑制组织内源性生物素。3)3)进入进入3 3H H2 20 02 210min10min。4 4）加上）加上生物素标记生物素标记的凝集素，在潮湿容器内室温的凝集素，在潮湿容器内室温45min45min。（用前由自己筛选最佳使用浓度）用前由自己筛选最佳使用浓度）5)PBS 5min5)PBS 5min3 3。6)6)加上加上ABCABC混合液混合液，室温，室温30min30min。7)PBS 5min7)PBS 5min3 3。8)DAB8)DAB染色，必要时苏木素对比染色。染色，必要时苏木素对比染色。对照切片在步骤对照切片在步骤4 4用蒸馏水代替生物素

36、标记的凝集素用蒸馏水代替生物素标记的凝集素 (3)(3)结果结果 阳性部位呈黄棕色阳性部位呈黄棕色。3 凝集素的ABC法(1)1)原理原理细胞膜上的相应糖基细胞膜上的相应糖基+生物素化凝集素生物素化凝集素+ABC+ABC复合物复合物29ppt课件四 其它亲和细胞化学1 1 阴（阳）离子与阳（阴）离子部位阴（阳）离子与阳（阴）离子部位阳离子化铁蛋白检测细胞膜表面阴离子阳离子化铁蛋白检测细胞膜表面阴离子-电镜电镜溶菌酶作为阳离子探针检测毛细血管壁阴离子分布溶菌酶作为阳离子探针检测毛细血管壁阴离子分布肝素作为阴离子探针用于检测细胞阳离子部位肝素作为阴离子探针用于检测细胞阳离子部位2 2 配体和受体：配体和受体：激素和受体；脂蛋白和受体激素和受体；脂蛋白和受体30ppt课件