生药学-第三章生药的有效性评价课件.ppt

1、第三章第三章 生药的有效性评价生药的有效性评价主讲人主讲人:欧阳臻欧阳臻引言引言 生药的有效性取决于其所含的化学成分，生药的有效性取决于其所含的化学成分，只要生药中所含化学成分的组成和相对含只要生药中所含化学成分的组成和相对含量稳定，生药的治疗作用就是稳定的。量稳定，生药的治疗作用就是稳定的。所以目前大多数生药的有效性可以通过对所以目前大多数生药的有效性可以通过对生药中与疗效相关联的化学成分的定性、生药中与疗效相关联的化学成分的定性、定量分析来评价。定量分析来评价。引言引言 生药的有效性取决于其所含生药的有效性取决于其所含的的化学成分化学成分，所以目前大多数，所以目前大多数生药的有效性可以通过

2、对生药生药的有效性可以通过对生药中与疗效相关联的化学成分的中与疗效相关联的化学成分的定性、定量分析来评价定性、定量分析来评价24351定量分析方法的方法学验证定量分析方法的方法学验证生药化学成分的分析方法生药化学成分的分析方法生药中各类成分及定性定量分析生药中各类成分及定性定量分析生药中多类成分的同时定量分析生药中多类成分的同时定量分析 生药的生物效应评价法生药的生物效应评价法本章内容本章内容第一节第一节 生药化学成分的分析方法生药化学成分的分析方法 生药化学成分的分析方法有多种，其生药化学成分的分析方法有多种，其中中分光光度法分光光度法和和色谱法色谱法是目前常用的是目前常用的方法。方法。一、

3、紫外一、紫外-可见分光光度法可见分光光度法 分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的光吸收度，对该长处或一定波长范围内的光吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。物质进行定性和定量分析的方法。紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrometry)是根据物质分子对波长为是根据物质分子对波长为200760nm这一范围的电磁波的吸收特性这一范围的电磁波的吸收特性所建立的光谱分析方法。所建立的光谱分析方法。中药中有紫外吸收的成分或本身有颜色的中药中有紫外吸收的成分或本身有颜色的成分，在一定的浓度

4、范围内，其溶液的吸成分，在一定的浓度范围内，其溶液的吸收度与浓度符合朗伯收度与浓度符合朗伯-比尔定律，均可用此比尔定律，均可用此法进行分析。法进行分析。本法适于生药中大类成分的含量测定，如本法适于生药中大类成分的含量测定，如总黄酮、总蒽醌、总生物碱总黄酮、总蒽醌、总生物碱等。等。二、色谱法二、色谱法 色谱法色谱法(chromatography)根据其分离原理可分为：根据其分离原理可分为：吸附色谱法吸附色谱法 分配色谱法分配色谱法 离子交换色谱法离子交换色谱法 排阻色谱法等。排阻色谱法等。吸附色谱法吸附色谱法 利用被分离物质在利用被分离物质在吸附剂上吸附能力吸附剂上吸附能力的不的不同，用溶剂或气

5、体洗脱使组分分离同，用溶剂或气体洗脱使组分分离 常用的吸附剂有常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺氧化铝、硅胶、聚酰胺等等有吸附活性的物质。有吸附活性的物质。分配色谱分配色谱 利用被分离物质在利用被分离物质在两相中分配系数的不同两相中分配系数的不同使组分分离；其中一相被涂布或键合在固使组分分离；其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为体载体上，称为固定相固定相，另一相为液体或，另一相为液体或气体，称为气体，称为流动相流动相；常用的载体有常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉剂与纤维素粉等等。离子交换色谱离子交换色谱 利用被分离物质在利用被分离物质在离子交换树脂上交

6、换能离子交换树脂上交换能力的不同力的不同使组分分离；使组分分离；常用的树脂：阳离子交换树脂、阴离子交常用的树脂：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法分子排阻色谱法又称凝胶色谱法 利用被利用被分离物质分子大小的不同分离物质分子大小的不同导致在填导致在填料上渗透程度不同使组分分离；料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。常用色谱法又可根据分离方法分为：常用色谱法又可根据分离方法分为：薄层色

7、谱法薄层色谱法气相色谱法气相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（一）薄层色谱法（一）薄层色谱法 薄层色谱法薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)：将供试品溶液点于薄层板上，在展开容将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定扫描，用于鉴别、检查或含量测定 例：例：中国药典中国药典(2010年版年版)采用薄层色采用薄层色谱扫描法对

8、牛黄中胆酸进行含量测定。谱扫描法对牛黄中胆酸进行含量测定。缺点：由于受分离效能、检测灵敏度以及缺点：由于受分离效能、检测灵敏度以及测定结果精密度、重现性、准确度等方面测定结果精密度、重现性、准确度等方面的限制，薄层色谱法现较少应用于生药成的限制，薄层色谱法现较少应用于生药成分的含量测定分的含量测定（二）高效液相色谱法（二）高效液相色谱法 高效液相色谱法高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)是采用高是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。的色谱柱进行分离测定的

9、色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。信号。高效液相色谱仪分为：高效液相色谱仪分为：高压输液系统，进样高压输液系统，进样系统，分离系统和检系统，分离系统和检测系统。测系统。此外还配有辅助装置：此外还配有辅助装置：如梯度洗脱，自动进如梯度洗脱，自动进样及数据处理等。样及数据处理等。优点：分离效能高、分析速度快、重现性优点：分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高，应用范围广好、准确度和灵敏度高，

10、应用范围广 随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质谱检测器的商品化，本法已成为生药含量谱检测器的商品化，本法已成为生药含量测定的首选和主流方法。测定的首选和主流方法。中国药典中国药典(2010年版）一部应用高效液年版）一部应用高效液相色谱法测定含量的中药品种达相色谱法测定含量的中药品种达1700余项余项（三）气相色谱法（三）气相色谱法 气相色谱法气相色谱法系采用气体为流动相系采用气体为流动相(载气载气)流经流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进物质或其衍生物气化后，被载气

11、带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。积分仪或数据处理系统记录色谱信号。气相色谱法对含挥发性成分的生药应用较气相色谱法对含挥发性成分的生药应用较广广 中国药典中国药典(2010年版年版)采用气相色谱法采用气相色谱法用于丁香中丁香酚、八角茴香中反式茴香用于丁香中丁香酚、八角茴香中反式茴香脑、广藿香中百秋李醇、艾叶中桉油精的脑、广藿香中百秋李醇、艾叶中桉油精的含量测定，以及甘草、黄芪中有机氯农药含量测定，以及甘草、黄芪中有机氯农药残留量的检查。残留量的检查。（四）其它色谱分析方法（四）其它色谱分析方法 1.高效

12、毛细管电泳高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)高效毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流高效毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或分配系数的不同进电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或分配系数的不同进行高效、快速分离的行高效、快速分离的“液相色谱液相色谱”技术，它是经典电泳技技术，它是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。术和现代微柱分离相结合的产物。现在成为生物化学和分析化学中最受瞩目的、发展最快的现在成为生物化学和分析化学中最受瞩目的、发展最快的一种分离分析技术，它在

13、复杂样品的分离分析中将扮演越一种分离分析技术，它在复杂样品的分离分析中将扮演越来越重要的角色。来越重要的角色。2.毛细管电色谱毛细管电色谱(capillary electrochromatography，CEC）毛细管电色谱是综合了毛细管电色谱是综合了毛细管电泳和高效液相色谱毛细管电泳和高效液相色谱的优势而的优势而发展起来的新型高效电分离微柱液相色谱技术。发展起来的新型高效电分离微柱液相色谱技术。CEC一般采用熔融的石英毛细管柱，在柱内填充或管壁键合一般采用熔融的石英毛细管柱，在柱内填充或管壁键合固定相，用高压直流电源固定相，用高压直流电源(或外加一定的压力）代替高压泵，或外加一定的压力）代替

14、高压泵，产生电渗流产生电渗流(electroosmotic flow，EOF)代替压力驱动流动代替压力驱动流动相，溶质依据它们在流动相与固定相中的分配系数的不同和相，溶质依据它们在流动相与固定相中的分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得到分离，因而既能分离中性物质又能自身电泳淌度的差异得到分离，因而既能分离中性物质又能分离带电组分。分离带电组分。近年来，高效毛细管电泳和毛细管电色谱在生药化学成分的近年来，高效毛细管电泳和毛细管电色谱在生药化学成分的分析中有许多尝试，取得显著进展。分析中有许多尝试，取得显著进展。第二节第二节 定量分析方法的方法学验证定量分析方法的方法学验证 定量分析方法验证的定量

15、分析方法验证的目的目的是证明采用的含是证明采用的含量测定方法适合于相应分析要求，在进行量测定方法适合于相应分析要求，在进行定量分析方法学研究或起草药品质量标准定量分析方法学研究或起草药品质量标准时，分析方法需经验证。时，分析方法需经验证。定量分析方法验证内容：定量分析方法验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性范围、耐用性。限、线性范围、耐用性。一、准确度一、准确度 准确度准确度(accuracy)：指用该方法测定的结：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率回收率()表示。表示。准确度应

16、在规定的范围内测试。准确度应在规定的范围内测试。用于定量用于定量测定的分析方法均需做准确度验证测定的分析方法均需做准确度验证。测定方法的准确度：测定方法的准确度：可用已知纯度的对照品做加样回收率测定，即于可用已知纯度的对照品做加样回收率测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。计算回收率。回收率回收率%=%100BACA为供试品所含被测成分量；为供试品所含被测成分量

17、；B为加入对照品量；为加入对照品量；C为实测值为实测值 二、精密度二、精密度 精密度精密度（precision）是指在规定的测试条）是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。定所得结果之间接近的程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。偏差表示。精密度包含重复性、中间精密度和重现性。精密度包含重复性、中间精密度和重现性。在相同操作条件下，由同一分析人员在较短的时在相同操作条件下，由同一分析人员在较短的时间间隔内测定所得结果的精密度称为间间隔内测定所得结果的精密度称为重复性重复

18、性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度称为同设备测定结果之间的精密度称为中间精密度中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度称为密度称为重现性重现性。用于定量测定的分析方法均应考察方法的精密度。用于定量测定的分析方法均应考察方法的精密度。三、专属性三、专属性 专属性（专属性（specificity）系指在其他成分可）系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出被测能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。成分的特性。通常以不含被测成分的供试品作为空白样

19、通常以不含被测成分的供试品作为空白样品，进行空白实验来说明方法的专属性。品，进行空白实验来说明方法的专属性。四、检测限四、检测限 检测限（检测限（limit of detection,LOD）是指供试品）是指供试品中被测成分能被检测出的最低浓度或量。中被测成分能被检测出的最低浓度或量。检测限是一种限度检验效能指标，反映方法与仪检测限是一种限度检验效能指标，反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白空白(本底本底)值的高低。它无需定量测定，只要指值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。根据所采出高于或低于该规定的

20、浓度或量即可。根据所采用的分析方法来确定检测限。用的分析方法来确定检测限。当用当用GC和和HPLC法时，可用已知低浓度样法时，可用已知低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。度或量。一般以一般以S/N=2或或S/N=3时的相应浓度或注时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限入仪器的量确定检测限。五、定量限五、定量限 定量限（定量限（limit of quantification,LOQ）是）是指供试品中被测成分能被定量测定的最低指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应

21、具有一定准确度和精密量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。度。常用信噪比法测定定量限。一般以常用信噪比法测定定量限。一般以S/N=10时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。六、线性六、线性 线性（线性（linearity）是指在设计的范围内，测试结）是指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测成分浓度直接呈正比关系的程果与供试品中被测成分浓度直接呈正比关系的程度。度。应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备品

22、的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试品。个浓度的供试品。以测得的响应信号作为被测成分的函数作图，观以测得的响应信号作为被测成分的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。回归方程的相关系数归计算。回归方程的相关系数(r)越接近于越接近于1，表，表明线性关系越好。明线性关系越好。七、范围七、范围 范围（范围（range）系指能达到一定精密度、准）系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间

23、。或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。范围应大于被限定含量的区间。八、耐用性八、耐用性 耐用性耐用性(robustness)系指在测定条件有小的变动时，测定系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。据。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、典型的变动因素有：被测溶液的稳定性

24、，样品提取次数、时间等。时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成比例或液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成比例或pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速及检测波长等。速及检测波长等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。薄相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。薄层色谱的变动因素有：不同厂牌的薄层板，点样方式及薄层色谱的变动因素有：不同厂牌的薄层板，点样方式及薄层展开时温度及相对湿度的变化等。层展开时温度

25、及相对湿度的变化等。第三节第三节 生药中各类成分及定性定量分析生药中各类成分及定性定量分析一、黄酮类化合物一、黄酮类化合物（一）结构类型（一）结构类型 黄酮类化合物指具有黄酮类化合物指具有2-苯基色原酮（苯基色原酮（2-phenyl-chromone）结构的化合物。结构的化合物。目前此类化合物已远远超过这个范围，主要是指两个苯目前此类化合物已远远超过这个范围，主要是指两个苯环中央通过三碳链连接形成环中央通过三碳链连接形成C6-C3-C6基本骨架的一类化合基本骨架的一类化合物的总称。物的总称。OO12345867OO12345867123456O12345867123456ABC 色原酮 2-苯

26、基色原酮 C6-C3-C6根据中央三碳链的氧化程度，根据中央三碳链的氧化程度，B-环连接位置（环连接位置（2-或或3-位）以及三碳链是位）以及三碳链是否构成环状等特点，将主要的天然黄酮类化合物分类如下：否构成环状等特点，将主要的天然黄酮类化合物分类如下：OOOOOHOOOOOHO+OHOO 黄酮类 黄酮醇类 二氢黄酮类 二氢黄酮醇类 花色素类 双苯吡酮类(flavones)(flavonol)(flavanones)(flavanonols)(anthocyanidins)(xanthones)OOOOOOHOOHOHOOOCH 黄烷-3-醇类 异黄酮类 二氢异黄酮 查耳酮类 二氢查耳酮 橙酮

27、类(flavan-3-ols)(isoflavones)(isoflavanones)(chalcones)(dihydrochalcones)(aurones)（二）分布与活性（二）分布与活性 黄酮类化合物在植物界中分布广泛黄酮类化合物在植物界中分布广泛 主含黄酮类成分的生药有银杏叶、卷柏、侧柏叶、主含黄酮类成分的生药有银杏叶、卷柏、侧柏叶、石韦、淫羊藿、葛根、甘草、黄芪、沙苑子、黄石韦、淫羊藿、葛根、甘草、黄芪、沙苑子、黄芩、山楂叶、槐花、黄蜀葵花、密蒙花、萹蓄、芩、山楂叶、槐花、黄蜀葵花、密蒙花、萹蓄、苍耳子、佛手、陈皮、射干、蒲黄等。苍耳子、佛手、陈皮、射干、蒲黄等。槐花槐花银杏叶银杏

28、叶葛根葛根 黄酮类化合物是药用植物的主要活性成分之一，具有黄酮类化合物是药用植物的主要活性成分之一，具有保护保护心脑血管系统、抗氧化、抗肿瘤、雌激素样作用以及抗炎、心脑血管系统、抗氧化、抗肿瘤、雌激素样作用以及抗炎、抗菌、抗病毒等广谱抗菌、抗病毒等广谱的生理活性。的生理活性。许多黄酮类化合物具有极强的生物活性。银杏双黄酮许多黄酮类化合物具有极强的生物活性。银杏双黄酮(ginkgetin)、槲皮素、葛根黄素、槲皮素、葛根黄素(puerarin)、芦丁、芦丁(rutin)等等均具有扩张血管作用，用于治疗冠心病。均具有扩张血管作用，用于治疗冠心病。芦丁、橙皮苷芦丁、橙皮苷(hesperidin)具有

29、维生素具有维生素P样作用，能降低血样作用，能降低血管脆性，用于防治高血压、脑血管破裂和动脉硬化的辅助管脆性，用于防治高血压、脑血管破裂和动脉硬化的辅助治疗剂。治疗剂。山楂黄酮、山奈酚山楂黄酮、山奈酚(kaempferol)等具有降低血脂及胆固醇等具有降低血脂及胆固醇作用。异甘草苷元作用。异甘草苷元(isoliquiritigenin)及大豆素（及大豆素（daidzein）具有解除平滑肌痉挛作用。具有解除平滑肌痉挛作用。黄芩苷黄芩苷(baicalin)、水飞蓟素、水飞蓟素(silybin)有很强的保肝作用，有很强的保肝作用，用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及多种中毒性肝损伤。用于治疗急、慢性肝炎、肝

30、硬化及多种中毒性肝损伤。（三）理化性质（三）理化性质 1.1.通性通性 黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙酸乙酯、乙醚。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶，而难溶于乙醚、三醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶，而难溶于乙醚、三氯甲烷、苯。氯甲烷、苯。黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。胺中。有些黄酮类化合物在紫外光有些黄酮类化合物在紫外光(254nm或或365n

31、m)下下呈不同颜色的荧光，以氨蒸气或碳酸钠溶液处理呈不同颜色的荧光，以氨蒸气或碳酸钠溶液处理后荧光更为明显。后荧光更为明显。2.2.鉴别反应鉴别反应（1）.盐酸盐酸-镁粉还原反应镁粉还原反应 取生药粉末少许置于试管中，用乙醇或甲醇数毫升温取生药粉末少许置于试管中，用乙醇或甲醇数毫升温浸，滤液加镁粉少许振摇，滴加数滴浓盐酸。黄酮类、浸，滤液加镁粉少许振摇，滴加数滴浓盐酸。黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇、二氢黄酮醇类显红二氢黄酮类、黄酮醇、二氢黄酮醇类显红紫红色，异紫红色，异黄酮类、查耳酮类、花色素类及部分橙酮不显色。本反黄酮类、查耳酮类、花色素类及部分橙酮不显色。本反应机理为生成阳碳离子所致。应机理

32、为生成阳碳离子所致。（2）金属盐类试剂的络合反应）金属盐类试剂的络合反应 具有下列结构单元的黄酮类化合物与铝盐、镁盐、铅盐、具有下列结构单元的黄酮类化合物与铝盐、镁盐、铅盐、锆盐等试剂反应，生成有色络合物。常用的试剂有三氯锆盐等试剂反应，生成有色络合物。常用的试剂有三氯化铝、醋酸铅、醋酸镁、二氯氧化锆等化铝、醋酸铅、醋酸镁、二氯氧化锆等OOHOOHOOHOHOOOOOAl/3ZrOCl（四）黄酮类主要定量方法（四）黄酮类主要定量方法 黄酮类化合物常可与某些试剂（如硝酸铝和亚硝黄酮类化合物常可与某些试剂（如硝酸铝和亚硝酸钠等）形成稳定的有色络合物，利用这一性质酸钠等）形成稳定的有色络合物，利用这

33、一性质可以采用可见可以采用可见-紫外分光光度法定量分析生药中总紫外分光光度法定量分析生药中总黄酮的含量，如黄酮的含量，如中国药典中国药典（2010年版）山楂年版）山楂叶中总黄酮的紫外叶中总黄酮的紫外-可见分光光度法测定。可见分光光度法测定。生药中单体黄酮可采用高效液相色谱法测定生药中单体黄酮可采用高效液相色谱法测定 金银花中黄酮类化合物的高效液相色谱法测定金银花中黄酮类化合物的高效液相色谱法测定对照品：对照品：芦丁（芦丁（rutin）（）（1）、）、金丝桃苷（金丝桃苷（hyperoside）（）（2）；）；木犀草素木犀草素-7-O-D-半乳糖苷（半乳糖苷（luteolin-7-O-D-gala

34、ctoside）（3）；）；忍冬苷（忍冬苷（lonicerin）（）（4）；）；tricin-7-O-D-glucopyranoside（5）；）；chrysoeirol-7-O-neohesperidoside（6）；）；tricin-7-O-neohesperidoside（7）槲皮素（槲皮素（quercetin）（）（8）。）。OR4OOH OR3R1OHR2R1R2R3R41OHHglc(6-1)rhaH2OHHgalH3OHHHgal4OHHOHglc(6-1)rha5OCH3OCH3Hglc6OCH3HHglc(2-1)rha7OCH3OCH3Hglc(2-1)rha8OHHOHH

35、 色谱柱色谱柱：Extend-C18(250 4.6 mm，5 m)；柱温柱温：30；流动相流动相：（：（A）1.2%四氢呋喃和四氢呋喃和0.5%乙酸，（乙酸，（B）40%甲醇甲醇 和和60%乙腈；乙腈；梯度洗脱梯度洗脱：10%20%B(012min)，20%B(1245 min)，20%58%B(4560 min)；流速流速：1.0 ml/min；检测波长检测波长：355nm。代表性色谱图代表性色谱图 min01020304050mAU 02040608010012345678min01020304050mAU 0204060801001234567812345678min010203040

36、50mAU 020406080100120123478min01020304050mAU 020406080100120123478AB对照品及样品高效液相色谱图对照品及样品高效液相色谱图A.混合对照品；混合对照品；B.样品。样品。色谱峰对应成分与对照品标注一致。色谱峰对应成分与对照品标注一致。二、蒽醌类二、蒽醌类（一）结构（一）结构 凡具有如下基本结构的成分称蒽醌类凡具有如下基本结构的成分称蒽醌类(anthraquinones)。由蒽的衍生物与糖结合的苷叫做蒽苷由蒽的衍生物与糖结合的苷叫做蒽苷。OO12345678生药中存在的蒽醌衍生物都是羟基蒽醌及其苷。大生药中存在的蒽醌衍生物都是羟基蒽醌

37、及其苷。大多数的蒽醌苷是蒽醌的羟基与糖缩合而成。也有少多数的蒽醌苷是蒽醌的羟基与糖缩合而成。也有少数是蒽醌的碳原子与糖直接连结而成。数是蒽醌的碳原子与糖直接连结而成。主要蒽醌类基本结构：主要蒽醌类基本结构：OOHOOOOCH3OHOOOOHOHOHH3C氧化蒽酚氧化蒽酚二蒽酮二蒽酮蒽酮蒽酮二蒽醌二蒽醌(山扁豆醌山扁豆醌)（二）分布（二）分布 蒽醌类化合物较集中分布于蓼科、鼠李科、蒽醌类化合物较集中分布于蓼科、鼠李科、豆科、茜草科、百合科、杜鹃花科、马鞭豆科、茜草科、百合科、杜鹃花科、马鞭草科等。草科等。主含蒽醌类成分的生药主含蒽醌类成分的生药有大黄、何首乌、有大黄、何首乌、虎杖、茜草、巴戟天、

38、番泻叶、决明子、虎杖、茜草、巴戟天、番泻叶、决明子、芦荟等芦荟等 药理活性药理活性 大黄中的大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄中的大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄酸等对多种细菌均有不同程度的抑制大黄酸等对多种细菌均有不同程度的抑制作用，且大黄不仅本身具有广谱抗菌作用，作用，且大黄不仅本身具有广谱抗菌作用，还对其它抗菌药物有协同增效作用；还对其它抗菌药物有协同增效作用；芦荟中的蒽醌类物质对带状疱疹病毒、包芦荟中的蒽醌类物质对带状疱疹病毒、包膜病毒、水痘、假狂犬病毒等有抑制作用膜病毒、水痘、假狂犬病毒等有抑制作用 天然蒽醌类化合物多具有致泻作用，且蒽天然蒽醌类化合物多具有致泻作用，且蒽醌苷的致泻作用

39、一般要强于苷元醌苷的致泻作用一般要强于苷元（三）理化性质（三）理化性质 1.通性通性 蒽醌类成分具升华性，常压下加热即可升华。蒽醌类成分具升华性，常压下加热即可升华。游离蒽醌及其还原型蒽醌可溶于丙酮、甲醇、乙游离蒽醌及其还原型蒽醌可溶于丙酮、甲醇、乙醇，微溶于苯、乙醚、三氯甲烷，难溶于水。醇，微溶于苯、乙醚、三氯甲烷，难溶于水。结合蒽醌（含还原型）易溶于甲醇、乙醇、丙酮、结合蒽醌（含还原型）易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，也溶于冷水，几乎不溶于苯、乙醚、乙酸乙酯，也溶于冷水，几乎不溶于苯、乙醚、三氯甲烷等。三氯甲烷等。2.鉴别反应鉴别反应（1）与碱的显色反应）与碱的显色反应 羟基蒽醌类能溶解

40、羟基蒽醌类能溶解于碱溶液中，而显红色或紫红色，加酸后于碱溶液中，而显红色或紫红色，加酸后颜色消失，若再加碱又显红色。蒽酚、蒽颜色消失，若再加碱又显红色。蒽酚、蒽酮、二蒽酮类必须被氧化成蒽醌后，才会酮、二蒽酮类必须被氧化成蒽醌后，才会呈阳性反应。呈阳性反应。此反应可以在生药断面、粉末或取生药浸此反应可以在生药断面、粉末或取生药浸出液滴于滤纸上进行。出液滴于滤纸上进行。（2）Borntrgers反应反应 取生药粉末少许取生药粉末少许于试管中，加碱液数毫升，振摇后过滤，于试管中，加碱液数毫升，振摇后过滤，得红色的滤液，加盐酸酸化后，溶液转为得红色的滤液，加盐酸酸化后，溶液转为黄色，加乙醚黄色，加乙醚

41、2ml，振摇后静置分层，乙醚，振摇后静置分层，乙醚层显黄色，分取醚层于另一试管中，加碱层显黄色，分取醚层于另一试管中，加碱液振摇，水层显红色。显示羟基蒽醌类成液振摇，水层显红色。显示羟基蒽醌类成分存在。分存在。（3）乙酸镁反应）乙酸镁反应 取生药粉末的乙醇浸出取生药粉末的乙醇浸出液于试管中，加入乙酸镁甲醇液，加热片液于试管中，加入乙酸镁甲醇液，加热片刻，即可显色。此反应也可在滤纸上进行，刻，即可显色。此反应也可在滤纸上进行，即将生药的乙醇浸出液滴于滤纸上，干后即将生药的乙醇浸出液滴于滤纸上，干后喷雾乙酸镁甲醇液，加热片刻即显色。喷雾乙酸镁甲醇液，加热片刻即显色。狭叶番泻狭叶番泻Cassia a

42、ngustifolia Vahl叶中番泻苷叶中番泻苷A和番泻苷和番泻苷 B的高效液相色谱分析的高效液相色谱分析 对照品对照品：番泻苷：番泻苷A（sennoside A）和番泻苷）和番泻苷B（sennoside B）。）。sennoside Asennoside B 色谱柱色谱柱：Zorbax Eclips XDB-C8(150 4.6mm，5.0m)；柱温柱温：25；流动相流动相：(A)0.1%三氟乙酸和三氟乙酸和(B)乙腈；乙腈；梯度洗脱梯度洗脱：12%B(020min)，12%13%B(2030 min)，13%16%B(3035 min)，16%19%B(3545 min)，19%25%

43、B(4548 min)，25%B(4852 min)；流速流速：1.0ml/min；检测波长检测波长：340nm。代表性色谱图代表性色谱图 Time(min)狭叶番泻叶提取物高效液相色谱图狭叶番泻叶提取物高效液相色谱图1.sennoside B;2.sennoside A三、皂苷类三、皂苷类 皂苷皂苷(saponins)是广泛存在于植物界的一是广泛存在于植物界的一类特殊的苷类成分，它的水溶液振摇后可类特殊的苷类成分，它的水溶液振摇后可生产持久的肥皂样的泡沫，因而得名。生产持久的肥皂样的泡沫，因而得名。根据水解后生成皂苷元的结构，皂苷可分根据水解后生成皂苷元的结构，皂苷可分为为三萜皂苷与甾体皂苷

44、三萜皂苷与甾体皂苷两大类。两大类。组成皂苷的糖常见的有葡萄糖、半乳糖、组成皂苷的糖常见的有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等，常与皂苷元半乳糖醛酸等，常与皂苷元C3位的位的-OH连连接成苷。接成苷。一、三萜皂苷：三萜皂一、三萜皂苷：三萜皂苷的皂苷元为苷的皂苷元为30个碳原个碳原子组成的三萜类衍生物。子组成的三萜类衍生物。大多数苷元在大多数苷元在C24或或C28位有位有-COOH基，故基，故又称酸性皂苷；少数苷又称酸性皂苷；少数苷元只含醇羟基而呈中性，元只含醇羟基而呈中性，如人参皂苷、柴胡皂苷如人参皂苷、柴胡皂苷等。等。三萜皂苷元

45、的结构可三萜皂苷元的结构可分为分为 五环三萜及四环五环三萜及四环三萜三萜HHH1351079131718202324252627282930HHH1351079131718202324252627282930HHH13510791317202324252627282930H19HH135107913171820242526282930H2327齐墩果烷 乌苏烷羽扇豆烷 木栓烷（一）皂苷结构类型（一）皂苷结构类型1、五环三萜皂苷、五环三萜皂苷2、四环三萜皂苷、四环三萜皂苷HHH13510717182021192627282930HHH13510717182021192627282930HHH13

46、510717182021192627282930H13510717202119262728293018HHH13510717182021192627282930HHH达玛烷 羊毛脂烷 甘遂烷环阿屯烷 葫芦烷 楝烷OOHHHHABCDEFOOHHHHOOHHHH2022252627HO17202225262717HOOHHHHHOOHOH202225262717OHHHH20222627HO17OCH2OH25螺甾烷 螺甾烷醇 异螺甾烷醇呋甾烷醇 变形螺甾烷醇二、甾体皂苷二、甾体皂苷甾体皂苷的皂苷元由甾体皂苷的皂苷元由27个碳原子组成，其不含羧基，呈中性，故又称中性个碳原子组成，其不含羧基，呈中

47、性，故又称中性皂苷皂苷（二）分布与活性（二）分布与活性 三萜皂苷三萜皂苷大多分布于双子叶植物，集中分布的科大多分布于双子叶植物，集中分布的科包括毛茛科、豆科、伞形科、五加科、菊科、蔷包括毛茛科、豆科、伞形科、五加科、菊科、蔷薇科、鼠李科、桔梗科、远志科、葫芦科、石竹薇科、鼠李科、桔梗科、远志科、葫芦科、石竹科、蒺藜科等科、蒺藜科等 主含主含三萜皂苷三萜皂苷的生药：人参、三七、西洋参、甘的生药：人参、三七、西洋参、甘草、黄芪、柴胡、党参、桔梗、南沙参、白头翁、草、黄芪、柴胡、党参、桔梗、南沙参、白头翁、酸枣仁、远志、山银花、地肤子等。酸枣仁、远志、山银花、地肤子等。人参人参柴胡柴胡黄芪黄芪 甾体

48、皂苷甾体皂苷大多分布于单子叶植物，较集中大多分布于单子叶植物，较集中分布的科有百合科、龙血树科、龙舌兰科、分布的科有百合科、龙血树科、龙舌兰科、薯蓣科等。此外，双子叶植物中的茄科也薯蓣科等。此外，双子叶植物中的茄科也富含甾体皂苷富含甾体皂苷 主含主含甾体皂苷甾体皂苷的生药：麦冬、天门冬、重的生药：麦冬、天门冬、重楼、知母、黄精、薤白、黄山药、穿山龙、楼、知母、黄精、薤白、黄山药、穿山龙、蒺藜等。蒺藜等。麦冬麦冬知母知母 1.通性通性 皂苷大多为白色或乳白色的无定形粉末，味苦而皂苷大多为白色或乳白色的无定形粉末，味苦而辛辣，具吸湿性，能刺激粘膜而引起喷嚏，无明辛辣，具吸湿性，能刺激粘膜而引起喷嚏

49、，无明显的熔点。显的熔点。可溶于水，易溶于热水、热甲醇、热乙醇，不溶可溶于水，易溶于热水、热甲醇、热乙醇，不溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。皂苷易溶于水饱和的丁醇或戊醇，皂苷易溶于水饱和的丁醇或戊醇，因此常从水溶因此常从水溶液中用丁醇或戊醇提取，借以与糖、蛋白质等亲液中用丁醇或戊醇提取，借以与糖、蛋白质等亲水性成分分开。水性成分分开。皂苷经酶或酸水解生成的皂苷元为结晶状物质，皂苷经酶或酸水解生成的皂苷元为结晶状物质，可溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂。可溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷等有机溶剂。皂苷的水溶液可以和一些金属盐类如铅盐、钡盐、皂苷的水溶液可以和一些金属盐类

50、如铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀。铜盐等产生沉淀。酸性皂苷的水溶液加入硫酸铵、乙酸铅或其它中酸性皂苷的水溶液加入硫酸铵、乙酸铅或其它中性盐类即产生沉淀。性盐类即产生沉淀。中性皂苷的水溶液则需加入碱式乙酸铅等碱性盐中性皂苷的水溶液则需加入碱式乙酸铅等碱性盐或氢氧化钡等才能产生沉淀。可用于皂苷的提取或氢氧化钡等才能产生沉淀。可用于皂苷的提取和分离。和分离。甾体皂苷在乙醇溶液中能与胆甾醇生成分子复合甾体皂苷在乙醇溶液中能与胆甾醇生成分子复合物而沉淀，当沉淀用乙醚回流时，胆甾醇可溶于物而沉淀，当沉淀用乙醚回流时，胆甾醇可溶于乙醚，而皂苷不溶，从而达到分离的目的。乙醚，而皂苷不溶，从而达到分离的目的。2.鉴