色谱法概述课件.ppt

1、主要内容主要内容 1 1 2 23 34 45 56 6 研究植物叶子的组成时，他将植物色素的石油醚浸取液通过填充有碳酸钙的直立玻璃管，再用纯净的石油醚自上而下淋洗，随着淋洗的进行，发现不同色素向下不同色素向下移动的速度不同移动的速度不同，最后色素中各组分互相各组分互相分离分离，形成不同颜色的谱带形成不同颜色的谱带。一、色谱法的起源一、色谱法的起源 1906年年由俄国植物学家由俄国植物学家Tswett创立创立色谱柱色谱柱流动相流动相固定相固定相石油醚石油醚色谱原型装置色谱原型装置玻璃管玻璃管碳酸钙碳酸钙谱带谱带二、色谱法的发展二、色谱法的发展 色谱方法的发展色谱方法的发展 色谱理论的发展色谱理

2、论的发展1.1.色谱方法的发展色谱方法的发展1968年前后 高效液相色谱法1975年 离子色谱法80年代初 超临界流体色谱法80年代中后期 毛细管电泳法90年代后期 毛细管电色谱法目前目前 胶囊色谱、手性分离色谱、高分辨色谱、多维色谱1935年 离子交换柱色谱法1941年 液液分配柱色谱法1944年 纸色谱法1952年 气相色谱法1956年 薄层色谱法1959年 凝胶柱色谱法 2.2.色谱理论的发展色谱理论的发展 在各种色谱方法建立的同时，色谱理论也在各种色谱方法建立的同时，色谱理论也逐步发展和成熟起来。主要有逐步发展和成熟起来。主要有:塔板理论塔板理论 速率理论速率理论 气相色谱发展初期，气

3、相色谱发展初期，Martin等人借助分馏中的塔板概念，等人借助分馏中的塔板概念，把色谱柱设想为由许多塔板组成的分馏塔，把色谱分离过程把色谱柱设想为由许多塔板组成的分馏塔，把色谱分离过程比拟作分馏过程，提出了表达柱效能模式的塔板理论。比拟作分馏过程，提出了表达柱效能模式的塔板理论。0 12345LH色谱柱色谱柱V（1 1）塔板理论塔板理论L:色谱柱柱长色谱柱柱长;H:理论塔板高度理论塔板高度;V：样品体积：样品体积 气相色谱兴起之后，科学家们在实际研究中发现得气相色谱兴起之后，科学家们在实际研究中发现得到的色谱峰往往是展宽的图形，塔板理论无法解释这种到的色谱峰往往是展宽的图形，塔板理论无法解释这

4、种现象。为此，荷兰学者现象。为此，荷兰学者Van Deemter等人于等人于1956年提年提出了速率理论。出了速率理论。该理论吸收了塔板理论中理论塔板高度该理论吸收了塔板理论中理论塔板高度的概念，并同时考虑影响理论塔板高度的动力学因素的概念，并同时考虑影响理论塔板高度的动力学因素（涡流扩散、分子扩散、传质阻力、载气流速等（涡流扩散、分子扩散、传质阻力、载气流速等），），研究色谱分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响研究色谱分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响，对对色谱分离条件的选择具有指导意义色谱分离条件的选择具有指导意义。速率理论为气相色谱法的实践提供了理论指导，同速率理论为气相色谱法的实践提

5、供了理论指导，同时为高效液相色谱法的创建提供了启迪和依据。时为高效液相色谱法的创建提供了启迪和依据。（2 2）速率理论速率理论气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效凝胶色谱高效凝胶色谱毛细管电泳毛细管电泳 经过一个世纪的发展，色谱法无论是在理论上、经过一个世纪的发展，色谱法无论是在理论上、方法上、设备上及文献资料上都已经成熟了；已被方法上、设备上及文献资料上都已经成熟了；已被广泛应用于医药卫生、食品、环境、材料、化工、广泛应用于医药卫生、食品、环境、材料、化工、农业及生命科学等各个领域，成为分离分析多组分农业及生命科学等各个领域，成为分离分析多组分混合物的极为重要的研究手段。混合物的极为

6、重要的研究手段。色谱法（色谱法（Chromatography）又叫色层法或层析）又叫色层法或层析法，是一种法，是一种分离分析技术分离分析技术，是分离分析多组分混合物是分离分析多组分混合物质的极有效的物理及质的极有效的物理及物理化学分析方法物理化学分析方法；是以试样中是以试样中各组分与固定相和流动相之间的相互各组分与固定相和流动相之间的相互作用力作用力（如吸附、（如吸附、分配、离子交换、排阻、亲和等作用力）分配、离子交换、排阻、亲和等作用力）的差异的差异为依为依据而建立起来的据而建立起来的各种分离分析方法各种分离分析方法。三、色谱法的定义、特点三、色谱法的定义、特点1、色谱法的定义、色谱法的定义

7、 固定不动的一相，称为固定不动的一相，称为固定相固定相，可以是固体或液体。可以是固体或液体。携带试样混合物流过固定相的流体称为携带试样混合物流过固定相的流体称为流动相流动相，可以可以是气体、液体或超临界流体。是气体、液体或超临界流体。内有固定相，用以分离混合物的柱管称为内有固定相，用以分离混合物的柱管称为色谱柱色谱柱。几个概念几个概念气相毛细管柱气相毛细管柱液相柱液相柱凝胶色谱柱凝胶色谱柱2、色谱法的特点、色谱法的特点分离效率高分离效率高分析速度快分析速度快灵敏度高灵敏度高样品用量少样品用量少选择性好选择性好多组分同时分析多组分同时分析分离和测定同时完成分离和测定同时完成应用广泛应用广泛易于自

8、动化易于自动化四、色谱法的分类四、色谱法的分类 按流动相和固定相的状态分类按流动相和固定相的状态分类 按固定相的操作方式分类按固定相的操作方式分类 按色谱过程的分离机制分类按色谱过程的分离机制分类 从色谱法的发展知，各种类型的色谱法很多，从色谱法的发展知，各种类型的色谱法很多，可从不同的角度对其进行分类。可从不同的角度对其进行分类。主要有以下三主要有以下三种：种：1、按流动相和固定相的状态分类、按流动相和固定相的状态分类随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种采用化学键合固定相的色谱法称为面，这种采用化学键合固定相的色谱法

9、称为键合相色谱法键合相色谱法(4)流动相流动相 固定相固定相 类类 型型液体液体 固体固体 液液-固色谱固色谱液体液体 液体液体 液液-液色谱液色谱气体气体 固体固体 气气-固色谱固色谱气体气体 液体液体 气气-液色谱液色谱 液相色谱液相色谱LC 气相色谱气相色谱GC(1)(2)(3)SFC超临界流体色谱超临界流体色谱超临界流体超临界流体2、按固定相的操作形式分类、按固定相的操作形式分类柱色谱柱色谱平面色谱平面色谱固定相装在管柱内固定相装在管柱内固定相呈平面状固定相呈平面状填充柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱毛细管柱色谱按照管柱的粗细和按照管柱的粗细和固定相的填充方式固定相的填充方式高分子薄膜色谱

10、高分子薄膜色谱薄层色谱薄层色谱纸色谱纸色谱按平面材料的不同按平面材料的不同n柱色谱法柱色谱法：将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附：将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。向移动而进行分离的色谱法。n纸色谱法纸色谱法：利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，：利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。根据滤

11、纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。以吸附水以吸附水分的滤纸作固定相分的滤纸作固定相n薄层色谱法薄层色谱法：将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。的。以涂敷在玻璃板上的吸附剂作固定相以涂敷在玻璃板上的吸附剂作固定相 3、按色谱过程的分离机制分类、按色谱过程的分离机制分类 吸附色谱法吸附色谱法分配色谱法分配色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法 亲和色谱法亲和色谱法生物色谱法生物色谱法（1）吸附色谱法：吸附色谱法：用固体吸

12、附剂作固定相，根据样品用固体吸附剂作固定相，根据样品中中不同组分在吸附剂上的物理吸附性能的差异不同组分在吸附剂上的物理吸附性能的差异进行分离。进行分离。如气固色谱法、液固色谱法。如气固色谱法、液固色谱法。（2）分配色谱法：）分配色谱法：用液体做固定相，根据用液体做固定相，根据不同组分在不同组分在固定相（液体）和流动相之间分配系数的不同固定相（液体）和流动相之间分配系数的不同进行分离。进行分离。如气液色谱法、液液色谱法。如气液色谱法、液液色谱法。（3）离子交换色谱法：）离子交换色谱法：固定相是离子交换剂，依据固定相是离子交换剂，依据离子型化合物中离子型化合物中各离子组分与离子交换剂各离子组分与离

13、子交换剂上表面带电上表面带电荷基团进行可逆性荷基团进行可逆性离子交换能力的差别离子交换能力的差别进行分离。进行分离。（4）尺寸排阻色谱法：）尺寸排阻色谱法：又叫凝胶色谱法或空间排阻又叫凝胶色谱法或空间排阻色谱法，用多孔性凝胶作固定相，根据色谱法，用多孔性凝胶作固定相，根据不同大小的组不同大小的组分分子在多孔性凝胶中的选择性渗透分分子在多孔性凝胶中的选择性渗透进行分离。进行分离。（5）亲和色谱法：）亲和色谱法：以在不同基体上键合多种不同特征以在不同基体上键合多种不同特征的配体作固定相（称固定化分子），的配体作固定相（称固定化分子），根据不同组分与固根据不同组分与固定相的高专属性亲和力定相的高专属

14、性亲和力进行分离。进行分离。（6）生物色谱法：）生物色谱法：采用各种具有生物活性的材料（例采用各种具有生物活性的材料（例如：酶、载体蛋白、细胞膜、活细胞等）作固定相，如：酶、载体蛋白、细胞膜、活细胞等）作固定相，利利用固定相与各种生物活性物质的选择性结合用固定相与各种生物活性物质的选择性结合进行分离进行分离。色谱法的简单分类色谱法的简单分类色谱法色谱法气相色谱法气相色谱法液相色谱法液相色谱法超临界流体色谱法超临界流体色谱法填充柱色谱法填充柱色谱法毛细管柱色谱法毛细管柱色谱法平面色谱法平面色谱法柱色谱法柱色谱法经典液相柱色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法薄层色谱法薄层色谱法纸色谱

15、法纸色谱法高分子薄膜色谱法高分子薄膜色谱法色谱过程色谱过程 色谱图色谱图五、色谱法的基本原理五、色谱法的基本原理 在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定相做相在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定相做相对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之间的对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之间的作作用力用力（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和其（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和其他亲和力等）他亲和力等）存在微小差别存在微小差别，使得不同组分被流动相运载使得不同组分被流动相运载移动的移动的速率不同速率不同，产生产生差速迁移差速迁移，使得结构和性质有微小使得结构和性质有微小

16、差别的不同组分按先后次序从固定相中流出而分离开来。差别的不同组分按先后次序从固定相中流出而分离开来。差速迁移差速迁移是色谱分离的基础。是色谱分离的基础。下面以吸附柱色谱法为例来学习色谱分离的过程和原理。下面以吸附柱色谱法为例来学习色谱分离的过程和原理。3.固定相固定相1.试样试样2.流动相流动相.4.色谱柱色谱柱图图17-1 17-1 色谱分离过程示意图色谱分离过程示意图组分组分A比组分比组分B先从色谱柱中流出，原因是什么？先从色谱柱中流出，原因是什么？组分组分A和和B结构和性质的不同导致它们与固定相的作用力不同结构和性质的不同导致它们与固定相的作用力不同 组分组分A与固定相的吸附作用力弱，随

17、流动相迁移与固定相的吸附作用力弱，随流动相迁移的速率快，先流出色谱柱；组分的速率快，先流出色谱柱；组分B与固定相的吸附作与固定相的吸附作用力强，随流动相迁移的速率慢，后流出色谱柱。用力强，随流动相迁移的速率慢，后流出色谱柱。u 色谱分离过程色谱分离过程 在吸附柱色谱法中，固定相是固体吸附剂，吸附剂对不同在吸附柱色谱法中，固定相是固体吸附剂，吸附剂对不同的组分表现出程度不同的吸附能力。待分离的组分随流动相通的组分表现出程度不同的吸附能力。待分离的组分随流动相通过吸附剂时，由于过吸附剂时，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附力吸附剂对不同组分有不同的吸附力，使得不使得不同组分随流动相迁移运载的同组分随

18、流动相迁移运载的速率不同速率不同，产生产生差速迁移差速迁移，最后使最后使得不同组分按先后次序流出色谱柱，实现得不同组分按先后次序流出色谱柱，实现分离分离。吸附吸附解吸附解吸附再吸附再吸附再解吸附再解吸附反复多次反复多次吸附吸附-解吸附解吸附分离分离差速迁移差速迁移吸附能力弱的组分先流出，吸附能力弱的组分先流出，吸附能力强的组分后流出。吸附能力强的组分后流出。各组分在结构和性质上的差异各组分在结构和性质上的差异微小差异积累微小差异积累较大差异较大差异作用力的差异作用力的差异 在在吸附柱色谱法吸附柱色谱法的整个分离过程中，始终贯穿着吸附的整个分离过程中，始终贯穿着吸附剂对被分离组分的剂对被分离组分

19、的吸附与解吸附作用吸附与解吸附作用。吸附剂对不同的组。吸附剂对不同的组分有不同的吸附能力，使得各组分在吸附剂上滞留的时间分有不同的吸附能力，使得各组分在吸附剂上滞留的时间不同，随流动相运动的速率不同而分离开来。分离过程是不同，随流动相运动的速率不同而分离开来。分离过程是一个一个吸附吸附-解吸附解吸附（脱附）的（脱附）的平衡平衡过程。过程。根据吸附柱色谱法的分离过程和原理可以根据吸附柱色谱法的分离过程和原理可以推断其他各种类型的色谱方法的分离过程和推断其他各种类型的色谱方法的分离过程和原理。原理。色谱分离过程的本质色谱分离过程的本质是待分离的组分在固定相和流动是待分离的组分在固定相和流动相之间分

20、配平衡的过程，不同组分在两相之间的分配不同，相之间分配平衡的过程，不同组分在两相之间的分配不同，使得各组分随流动相迁移的速度不相同，随着流动相的运使得各组分随流动相迁移的速度不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。简言之，动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。简言之，色谱分离过程就色谱分离过程就是试样中的各组分在色谱柱内两相（固定试样中的各组分在色谱柱内两相（固定相和流动相）间进行相和流动相）间进行多次多次“分配分配”的过程。的过程。由吸附柱色谱法知：色谱法利用不同组分在不同相态由吸附柱色谱法知：色谱法利用不同组分在不同相态（固定相和流动相）中的选择性分配，以流动相

21、对固定相（固定相和流动相）中的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱法的基本原理色谱法的基本原理是基于混合物中的各组分在固是基于混合物中的各组分在固定相和流动相之间的作用力差异、平衡分配的差异。定相和流动相之间的作用力差异、平衡分配的差异。综上所述，综上所述，色谱法是色谱法是利用混合物中各组分在两相利用混合物中各组分在两相（固定相和流动相）中吸附、分配、离子交换、亲和（固定相和流动相）中吸附、分配、离子交换、亲和力、分子尺寸等的差

22、异，使固定相对各组分的保留作力、分子尺寸等的差异，使固定相对各组分的保留作用不同，产生差速迁移而进行分离的方法。用不同，产生差速迁移而进行分离的方法。六、色谱流出曲线及有关术语六、色谱流出曲线及有关术语n色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰n基线基线n峰高峰高n保留值保留值n区域宽度区域宽度n分配系数分配系数n分配比分配比n分离度分离度n试样中各组分经色谱柱分离后，按先后试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度的变化转变为相应的电信中各组分浓度的变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的号，由记录仪所记录下的信号信号

23、时间时间曲线曲线或或信号信号流动相体积流动相体积曲线，称为曲线，称为色谱流出曲线色谱流出曲线，或，或色谱图。色谱图。n流出曲线流出曲线：色谱仪记录器记录的电信号强度对：色谱仪记录器记录的电信号强度对t作图所绘制的曲线。作图所绘制的曲线。n色谱峰色谱峰：曲线上突出的部分。曲线上突出的部分。n基线基线：色谱柱中：色谱柱中仅有流动相通过仅有流动相通过时，检测器响应时，检测器响应的信号记录，通常与横轴平行。基线反应检测器的信号记录，通常与横轴平行。基线反应检测器的噪音随时间的变化，稳定的基线应当是一条直的噪音随时间的变化，稳定的基线应当是一条直线。线。色谱峰色谱峰基线基线n峰高峰高（h）：色谱峰顶点与

24、基线之间的垂）：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。直距离。n峰面积峰面积（A）：色谱峰所包围的面积。）：色谱峰所包围的面积。n色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度：描述色谱流出曲线的：描述色谱流出曲线的另一个重要参数，用来量度色谱分离的另一个重要参数，用来量度色谱分离的效率，反映柱效的高低。效率，反映柱效的高低。区域宽度的三表示形式区域宽度的三表示形式n标准偏差标准偏差：0.6070.607倍峰高处色谱峰宽的一半倍峰高处色谱峰宽的一半n半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处对应的峰宽：峰高一半处对应的峰宽n峰底宽度峰底宽度W：峰两侧拐点上切线在基线上的截距：峰两侧拐点上切线在基线上的截距三者关系：三者关系：W

25、=4=1.699 W1/2保留值保留值n死时间死时间n保留时间保留时间n调整保留时间调整保留时间n死体积死体积n保留体积保留体积n调整保留体积调整保留体积n相对保留值相对保留值tVn保留时间保留时间tR：组分通过色谱柱所需的时间：组分通过色谱柱所需的时间n死时间死时间t0：不被保留的组分从进样到色谱：不被保留的组分从进样到色谱峰最大值出现的时间峰最大值出现的时间n调整保留时间调整保留时间tR：扣除死时间后的保留时：扣除死时间后的保留时间间tRtRt0n死体积死体积VM：指：指惰性组分惰性组分从进样开始到柱从进样开始到柱后出现后出现浓度极大点浓度极大点时时所通过的流动相体所通过的流动相体积积；指

26、从进样器到柱后出口未被固定相；指从进样器到柱后出口未被固定相所占据的一切空间。可由死时间与流动所占据的一切空间。可由死时间与流动相流速相流速Fc(mL/min)计算：计算：VM=tMFc n保留体积保留体积：从进样至被测组分出现最大：从进样至被测组分出现最大浓度时流动相通过的体积，浓度时流动相通过的体积，VR。n 调整保留体积调整保留体积VR：某组分的保留体积扣除死体积，：某组分的保留体积扣除死体积，称为该组分的调整保留体积。称为该组分的调整保留体积。n相对保留值相对保留值i.s：某组分的：某组分的调整保留值调整保留值与另一与另一基准物基准物的的调整保留值之比调整保留值之比。n注意：相对保留值

27、不是两个组分保留时间或保留体注意：相对保留值不是两个组分保留时间或保留体积之比；而是积之比；而是调整保留时间调整保留时间或或调整保留体积调整保留体积之比。之比。分配系数分配系数（partion factor）K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做挥发的过程叫做分配过程。分配过程。在一定温度下，在一定温度下，组分在两相间组分在两相间分配达到分配达到平衡时的浓度（单位：平衡时的浓度（单位：g/mL）比比，称为，称为分配系数分配系数，用用K 表示，即：表示，即：Ms ccK 组组分分在在流流动动相相中中的的浓浓度度组组分分在

28、在固固定定相相中中的的浓浓度度分配系数是色谱分离的依据。分配系数是色谱分离的依据。分配系数分配系数 K 的讨论的讨论 一定温度下，组分的分配系数一定温度下，组分的分配系数K越大越大，出峰越慢出峰越慢；试样一定时，试样一定时，K主要取决于固定相性质；主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数每个组份在各种固定相上的分配系数K不同不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础值是分离的基础；某组分的某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分

29、在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度组分在固定相中的浓度 K分配比分配比 （partion radio）k 在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是平衡过程。分配比是指在一定温度下，组分在两相指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比间分配达到平衡时的质量比：Ms mmk 组组分分在在流流动动相相中中的的质质量量组组分分在在固固定定相相中中的的质质量量分配比也称：分配比也称：容量因子容量因子(capacity factor)；容量比容量比(capacity factor)；1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力分配系数与分

30、配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.分配比可以由实验测得。分配比可以由实验测得。n分离度分离度:相邻两色谱峰保留值之差与两组相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比，用分色谱峰底宽度平均值之比，用R表示。表示。21)1()2(21)1()2()(22wwttwwttRRRRRtR(1)、tR(2)分别为组分分别为组分1

31、和组分和组分2的保留时的保留时间，间，w1、w2分别为相应组分色谱峰的峰分别为相应组分色谱峰的峰底宽度，与保留值的单位相同。底宽度，与保留值的单位相同。n根据色谱峰的个数判断样品所含组分的最少个数；根据色谱峰的个数判断样品所含组分的最少个数；n色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动相选择色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动相选择是否合适的依据；是否合适的依据；n色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；效能的依据；n根据色谱峰的保留值（或位置）进行定性分析。根据色谱峰的保留值（或位置）进行定性分析。n根据色谱峰下的面积或峰高进行定量分

32、析。根据色谱峰下的面积或峰高进行定量分析。色谱流出曲线上的重要信息色谱流出曲线上的重要信息七、反相色谱法七、反相色谱法RPCreversed-phase chromatographyn反相色谱法反相色谱法:包含了任何一种使用非极性固定相的色包含了任何一种使用非极性固定相的色谱学方法。谱学方法。n“反相反相”这个词有其历史背景。这个词有其历史背景。70年代，大多数液年代，大多数液相色谱是在相色谱是在未修饰未修饰的的氧化硅或氧化铝氧化硅或氧化铝上完成的，他们上完成的，他们表面的化学性质是亲水性的，对极性化合物具有更强表面的化学性质是亲水性的，对极性化合物具有更强的亲和力，因此叫做的亲和力，因此叫做

33、“正相正相”色谱。色谱。n若采用烷基链共价键合到支持表面上，则会倒换洗脱若采用烷基链共价键合到支持表面上，则会倒换洗脱顺序。反相色谱法中，顺序。反相色谱法中，极性化合物先被洗脱极性化合物先被洗脱出来，而出来，而非极性化合物被保持非极性化合物被保持住，因为它们亲和于反相表面。住，因为它们亲和于反相表面。n高效液相色谱法包括高效液相色谱法包括正相正相高效液相色谱法和高效液相色谱法和反反相相高效液相色谱法。高效液相色谱法。n正相高效液相色谱法正相高效液相色谱法：流动相的极性：流动相的极性固定相固定相的极性，也就是以极性键合相为固定相（常以的极性，也就是以极性键合相为固定相（常以氨基、氰基键合相等作为

34、固定相）。氨基、氰基键合相等作为固定相）。n反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法：流动相的极性：流动相的极性固定相固定相的极性，也就是以非极性键合相为固定相（常的极性，也就是以非极性键合相为固定相（常以十八硅烷以十八硅烷C18、辛烷、辛烷C8、甲基、甲基C1、苯基等作、苯基等作为固定相）。为固定相）。在其他色谱方法中所使用的所有数在其他色谱方法中所使用的所有数学与试验研究在反相色谱中亦适用（例学与试验研究在反相色谱中亦适用（例如色谱分辨率与柱长成正比）。如今，如色谱分辨率与柱长成正比）。如今，反相柱色谱法在分析型液相色谱中占绝反相柱色谱法在分析型液相色谱中占绝大多数比例大多数比例。n同一根柱子

35、，可能是正相，也可能是反相同一根柱子，可能是正相，也可能是反相，例如安捷伦例如安捷伦 ZORBAX CN柱，用正己烷柱，用正己烷-异异丙醇作流动相就是正相丙醇作流动相就是正相HPLC，用水，用水-甲醇甲醇/乙腈就是反相乙腈就是反相HPLC。注意注意HPLC法：法：以气相色谱为基础，在经典液相以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法八、高效液相色谱法八、高效液相色谱法主要区别：固定相差别，主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段输液设备和检测手段液相色谱仪的原理液相色谱仪的原理n由于样品溶液中的由于样品溶液中的各组分的性质不同各

36、组分的性质不同，导，导致它们在两相中致它们在两相中具有不同的分配系数具有不同的分配系数，在，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附附-解吸的分配过程，各组分在解吸的分配过程，各组分在移动速度上移动速度上产生较大的差别产生较大的差别，被分离成单个组分依次被分离成单个组分依次从色谱柱内流出从色谱柱内流出，通过，通过检测器检测器时，时，样品浓样品浓度被转换成电信号度被转换成电信号传送到传送到记录仪记录仪，数据以，数据以图谱图谱形式打印出来。形式打印出来。n储液器储液器中的中的流动相流动相被被高压泵高压泵打入系统，样品溶液经打入系统，样品溶液经进样进样器器进入流动

37、相，进入流动相，被流动相载入色谱柱被流动相载入色谱柱(固定相固定相)内。内。1经典经典LC：仅做为一种分离手段仅做为一种分离手段 柱内径柱内径13cm，固定相粒径固定相粒径100m 且不均匀且不均匀 常压输送流动相常压输送流动相 柱效低（柱效低（H，n）分析周期长分析周期长 无法在线检测无法在线检测2HPLC：分离和分析分离和分析 柱内径柱内径26mm，固定相粒径固定相粒径10m（球形，匀浆球形，匀浆装柱）装柱）高压输送流动相高压输送流动相 柱效高（柱效高（H，n）分析时间大大缩短分析时间大大缩短 可以在线检测可以在线检测1.分析对象分析对象 溶解后能制成溶液的样品溶解后能制成溶液的样品 不受

38、样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%2流动相流动相v流动相为流动相为液体液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液

39、体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3操作条件操作条件 室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）下列三个化合物用硅胶吸附色谱分离，以石油醚下列三个化合物用硅胶吸附色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯（95：5）洗脱，判断三者流出色谱柱的先后顺序。）洗脱，判断三者流出色谱柱的先后顺序。例题例题ABCCH3OOH 硅胶层析法硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离。一般，极性大，易吸附；极性弱，难吸附。同而得到分离。一般，极性大，易吸附；极性弱，难吸附。整个

40、层析过程即是吸附、解吸附、再吸附、再解吸附过程。整个层析过程即是吸附、解吸附、再吸附、再解吸附过程。烃烃酮酮醇醇SiOSiHOHOOSiHOOSiHO 硅胶（硅胶（SiO2xH2O）是由硅醇基和许多化合物形成）是由硅醇基和许多化合物形成氢键而具有一定的吸附作用，是通过对混合物质中不同氢键而具有一定的吸附作用，是通过对混合物质中不同成分的吸附保留时间的差异达到分离提纯的目的。成分的吸附保留时间的差异达到分离提纯的目的。答案：CBAu 色谱法的定义色谱法的定义u 色谱法的特点色谱法的特点u 色谱法的分类色谱法的分类u 色谱法的分离过程色谱法的分离过程u 色谱法的基本原理色谱法的基本原理应掌握的内容应掌握的内容（重点，难点重点，难点）1.根据色谱分离的机理，色谱法可分为哪几类？根据色谱分离的机理，色谱法可分为哪几类？2.什么是色谱法？色谱分离的基础是什么？什么是色谱法？色谱分离的基础是什么？作作 业业1试按流动相和固定相的不同将色谱法分类。试按流动相和固定相的不同将色谱法分类。2简单说明色谱法的分离过程和基本原理。简单说明色谱法的分离过程和基本原理。思考题思考题