细胞生物学实验技术(二)课件.ppt
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- 细胞生物学 实验 技术 课件
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1、动物细胞生物学动物细胞生物学实验技术实验技术主主 要要 内内 容容第一节第一节 培养细胞的生物学培养细胞的生物学第二节第二节 细胞培养基本实验室操作细胞培养基本实验室操作第三节第三节 细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术第二节、细胞培养第二节、细胞培养主主 要要 内内 容容(一)细胞培养所需条件(一)细胞培养所需条件(二)细胞培养所需用品(二)细胞培养所需用品(三)细胞培养液(三)细胞培养液(四)细胞的原代、继代培养(四)细胞的原代、继代培养(五)细胞的冻存和复苏(五)细胞的冻存和复苏(六)细胞污染(六)细胞污染(一)细胞培养所需条件(一)细胞培养所需条件 1 营养需要营养需要 2 细胞的生存
2、环境细胞的生存环境 温度温度:37 O2 CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-pH:7.2-7.4 渗透压渗透压 湿度湿度 3 无污染无污染 4 无毒无毒(二)细胞培养所需用品:(二)细胞培养所需用品:无菌间、超净工作台,压力蒸汽消毒器,电热干燥箱,滤器,酸缸,紫外灯 CO2培养箱 倒置显微镜 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器,纯水仪 耗材:培养瓶,吸管,电动吸引器,培养板,冻存管1 1超净工作台超净工作台(Hood):A.水平流超净工作台水平流超净工作台(Horizontal air flow)B.垂直流超净工作台垂直流超净工作台(Lateral air flow)水平流超净工作
3、台背送风,但病毒是不实用的,容易对人有害垂直流超净工作台超净工作台的清洁维护:超净工作台的清洁维护:保持工作台上无死角,让空气得到充分过滤,即试验完毕后,将所有的用品收藏起来,工作台上只留有酒精灯及橡皮头。工作前和工作完毕都要用酒精擦桌面,如果桌面滴有培养液等物,实验结束后应先用水擦,然后用酒精再擦。还需定期检测工作台滤器过滤的效率。整个接种操作应在近火焰处进行,且动作要迅速正正 确确 错错 误误接种过程中尽可能达到悬空要求接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染正正 确确 错错 误误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正 确确 错错 误误瓶盖朝上放,接种完
4、毕后立即盖好瓶口瓶盖朝上放,接种完毕后立即盖好瓶口正正 确确 错错 误误2,CO2培养箱培养箱CO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37,100%湿度,湿度,5CO2。使用使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题培养箱培养细胞时应注意的问题 用用螺旋口瓶螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖培养细胞时,需将瓶盖微松微松,以保证通气。,以保证通气。保持培养箱内保持培养箱内空气干净空气干净。定期消毒定期消毒(90,14 h)。箱内箱内灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水,毫升蒸馏水,以保持箱内湿度,避免培养液蒸以保持箱内湿度,避免培养液蒸发。发。湿度以第二天第湿度以第二天第一次开门,能看一次开门,能看到
5、玻璃门上的水到玻璃门上的水珠珠3 3消毒设备:消毒设备:A.A.高压消毒锅(高压消毒锅(AutoclaveAutoclave):):110 110 C C,15 lb15 lb,20 20 分钟,分钟,适合于橡皮、纸、布、塑料制品和液体(适合于橡皮、纸、布、塑料制品和液体(9 lb9 lb,10 10 分钟)等。分钟)等。消毒后必须在烤箱中低温烤干。消毒后必须在烤箱中低温烤干。B.B.干热消毒箱:干热消毒箱:150-200 150-200 C C,2-32-3小时。小时。适合于玻璃器皿、金属器械等。适合于玻璃器皿、金属器械等。C.C.酒精消毒酒精消毒:解剖器械、塑料器皿、动物皮毛解剖器械、塑料
6、器皿、动物皮毛 等,酒精浓度为等,酒精浓度为75759595。D.Co 60D.Co 60:放射性同位素:放射性同位素高压消毒锅高压消毒锅 D.D.滤膜过滤:滤膜过滤:正压过滤正压过滤:负压过滤:负压过滤:滤膜孔径为滤膜孔径为0.22m0.22m,为延长滤膜寿命可同时添,为延长滤膜寿命可同时添加加0.45 m0.45 m和和1.2 m 1.2 m 滤膜。滤膜。滤 膜 滤 器两种:1,一次性滤器;2,买滤膜自己装(需要消毒)4.4.蒸馏器与去离子纯水系统:蒸馏器与去离子纯水系统:1 1)用三蒸水,通过去离子纯水)用三蒸水,通过去离子纯水 系统,电阻需达到系统,电阻需达到170170万欧姆万欧姆以
7、上。以上。2 2)专门的去离子水系统)专门的去离子水系统5.5.倒置相差显微镜:倒置相差显微镜:需用需用相差镜头相差镜头和和滤光片滤光片,集光器的选择应与接物镜,集光器的选择应与接物镜的放大倍数一致。的放大倍数一致。纯水系统纯水系统 倒置相差显微镜1,物镜朝上2,工作距离大3,相差干涉5,培养器皿,培养器皿培养板与培养瓶培养板与培养瓶5,恒温水浴箱,血,恒温水浴箱,血清灭活,细胞解冻清灭活,细胞解冻6,移液管,移液管7 7,低速离心机,低速离心机RPMI-1640RPMI-1640(标准型)、(标准型)、DMEM-DMEM-高糖高糖(标准型)、(标准型)、DMEM-DMEM-低糖(标准型)、低
8、糖(标准型)、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F12F12等等Gibco干粉培养液液体培养液1,培养在使用之前需要加入的成分:血清、Na2CO3,丙酮酸钠、抗生素等Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根据需要的量进行分装,避免反复冻融,血清保存要放置20培养液的选择培养液的选择没有一定的标准,有几点建议可供参考没有一定的标准,有几点建议可供参考 选择培养选择培养这种细胞这种细胞首选的培养液。可以查阅参考文献,或在购买细首选的培养液。可以查阅参考文献,或在购买细胞株时咨询。胞株时咨询。其它实验室其它实验室惯用的培养液惯用的培养液不妨一试,许多培养液可以适合
9、多种细胞。不妨一试,许多培养液可以适合多种细胞。用用多种培养液多种培养液培养目的细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、集培养目的细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、集落形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基,这是最客观的落形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基,这是最客观的方法,但比较繁琐。方法,但比较繁琐。总之,首选总之,首选MEM做粘附细胞培养、做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养,做悬浮细胞培养,各种目的无血清培养的首选是各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基(培养基(SFM)。)。血清使用注意事项血清使用注意事项1.1.血清必须贮存于血清必须贮存于20 2
10、0 -70-70,若存放于,若存放于44,请勿超过一个月。,请勿超过一个月。1.1.血清血清解冻步骤解冻步骤(逐步解冻法逐步解冻法):-20):-20或或7070至至44冰箱冰箱溶解一天,至溶解一天,至室温室温下全溶后再分装。在溶解过程中须下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀规则摇晃均匀(小心勿造成气小心勿造成气泡泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由,使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由2020直接至直接至3737解冻,因温度改变太大,容易造成解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结蛋白质凝结而发生沉淀。而发生沉淀。1.1.热灭活(热灭活(heat-inactivati
11、onheat-inactivation)是指)是指56,30 56,30 分钟分钟加热已完全解冻之加热已完全解冻之血清。目的是使血清中之血清。目的是使血清中之补体成份补体成份(complement)(complement)去活化。除非必须,去活化。除非必须,一般不建议作此热处理一般不建议作此热处理,因为会造成沉淀物显著增多,且会影响血清,因为会造成沉淀物显著增多,且会影响血清之品质。之品质。1.1.勿将血清置于勿将血清置于3737太久,若在太久,若在3737放置太久,血清会变得混浊,同时放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较血清中许多较不稳定之成份不稳定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之
12、品质亦会因此受到破坏,而影响血清之品质补体系统原指血清中引起免疫性细胞溶解(抗体包裹细胞溶解)的不耐热因子;现指至少由20种截然不同的血清蛋白组成的完整功能相关系统。补体系统主要的功能是通過 在病原体表面的作用,破坏其细胞膜或者“调理”病原体表面供巨噬细胞吞食,此外还能引起发炎反应。加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。凝絮物:发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibri
13、n)造成,这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物,可用离心3000 rpm,5 min 去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物,因为会阻塞过滤膜。显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在37中欲培养此“微生物“,但在37环境下,又会使此沉淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品质,应立即停用,更换另一批号的血清。血清沉淀物血清沉淀物
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