第十四章:大肠杆菌基因工程资料课件.ppt
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- 第十四 大肠杆菌 基因工程 资料 课件
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1、第十四章第十四章 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征1.1.全基因组测序,遗传背景清楚全基因组测序,遗传背景清楚 ,共有共有44054405个开放阅读框架。个开放阅读框架。2.2.基因克隆表达系统成熟完善。基因克隆表达系统成熟完善。一一大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势3.3.繁殖迅速,培养简单,操作方便,繁殖迅速,培养简单,操作方便,遗传稳定。遗传稳定。4.4.被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程批准为安全的基因工程受体生物。受体生物。5.5.成本低成本低1.缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。缺乏对真核生物
2、蛋白质的加工系统。2.内源性蛋白酶易降解空间构象不正内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白。确的异源蛋白。3.不具备真核生物的蛋白质复性系统。不具备真核生物的蛋白质复性系统。4.其细胞膜间隙含有大量的内毒素,其细胞膜间隙含有大量的内毒素,可能混在产物里。可能混在产物里。二二大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理一一启动子启动子二二终止子终止子三三核糖体结合位点核糖体结合位点四四密码子密码子五五质粒拷贝数质粒拷贝数一一启动子启动子1.大肠杆菌启动子的强弱取决于大肠杆菌启动子的强弱取决于启动子本身的序
3、列,尤其是启动子本身的序列,尤其是-10-10区区和和-35-35区的碱基组成及彼此间的距区的碱基组成及彼此间的距离离启动子与外源基因转录起始位点启动子与外源基因转录起始位点之间的距离之间的距离2.启动子最佳作用距离的探测启动子最佳作用距离的探测其中目的基因表达量最高的克隆即具有最其中目的基因表达量最高的克隆即具有最佳的启动子作用距离。佳的启动子作用距离。若克隆菌细胞内检测不到相应的若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNAmRNA,有,有必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。3.启动子的筛选启动子的筛选采用鸟枪法战略,将合适大小的采用鸟枪法战略,将合适大小的DNA
4、DNA片段克隆到启动子探针质粒片段克隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上,上,受体细胞染色体受体细胞染色体DNADNA上的上的galEgalE、galTgalT与质粒报告基因与质粒报告基因galKgalK的表达产物联合的表达产物联合作用,能将培养基中的半乳糖糖酵解作用,能将培养基中的半乳糖糖酵解成红色素物质。成红色素物质。鸟枪法克隆鸟枪法克隆转化galE+、galT+的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性含有外源启动子活性的重组克隆的重组克隆依据依据RNARNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计的。将大肠杆菌基因组文库中的重组质粒与计的。将大肠杆菌基因组文
5、库中的重组质粒与RNARNA聚合酶在体外保温片刻,然后选择合适的限制性聚合酶在体外保温片刻,然后选择合适的限制性内切酶对其进行消化,未与内切酶对其进行消化,未与RNARNA聚合酶保温的同一聚合酶保温的同一重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片段比对照质粒减少,则表明被钝化的酶切位点位段比对照质粒减少,则表明被钝化的酶切位点位于于RNARNA聚合酶保护区域内,即该区域存在启动子结聚合酶保护区域内,即该区域存在启动子结构。将这个区域的构。将这个区域的DNADNA片段次级克隆在启动子探针片段次级克隆在启动子探针质粒上,测定其所含有启动子的转录活性。质粒上
6、,测定其所含有启动子的转录活性。酶保护法分离酶保护法分离原理是双链原理是双链DNADNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合,而不能与硝酸纤维素薄膜有效结合,而DNA-DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测DNADNA片段与片段与RNARNA聚合酶保温,并转移保温混合物至膜上,温聚合酶保温,并转移保温混合物至膜上,温和漂洗薄膜,除去未结合和漂洗薄膜,除去未结合RNARNA聚合酶的双链聚合酶的双链DNADNA片段,然后片段,然后再用高盐溶液将结合在薄膜上的再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNADNA片段洗下。一般来说,片段洗下。一般来说,这种
7、这种DNADNA片段在膜上的滞留程度与其同片段在膜上的滞留程度与其同RNARNA聚合酶的亲和性聚合酶的亲和性(即启动子的强弱)成比例,然而这种强弱难以量化,通(即启动子的强弱)成比例,然而这种强弱难以量化,通常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。滤膜结合法分离滤膜结合法分离4.常用的大肠杆菌的启动子常用的大肠杆菌的启动子P Placlac 来源于乳糖操纵子来源于乳糖操纵子P Ptrptrp 来源于色氨酸操纵子来源于色氨酸操纵子P PL L 来源于来源于噬菌体早期操纵子噬菌体早期操纵子P PrecArecA 来源于来源于recArecA基因基因5.5.启动子
8、的构建启动子的构建为了获得更强的启动子,除了从基因为了获得更强的启动子,除了从基因组组DNADNA上进行筛选甄别外,还可利用已上进行筛选甄别外,还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子,知的启动子重新构建新的杂合启动子,以满足不同外源基因的表达要求。以满足不同外源基因的表达要求。为了获得更强的启动子,除了从基因组DNA上进行筛选甄别外,还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子,以满足不同外源基因的表达要求。由Ptrp-35区序列和Plac-10区序列重组而成的杂合启动子Ptac,其相对强弱分别是Ptrp的三倍和Plac的11倍。6.启动子的可控性启动子的可控性乳糖启动子乳糖启动子P Pla
9、clac的可控性的可控性野生型的野生型的P Placlac与其控制区与其控制区O Olaclac偶联在偶联在一起,在没有诱导物存在时,整个一起,在没有诱导物存在时,整个操纵子处于基底水平表达;诱导物操纵子处于基底水平表达;诱导物可以使启动子可以使启动子P Placlac介导的转录大幅介导的转录大幅增加。增加。野生型的野生型的P Placlac上游附近具有代谢激活因子上游附近具有代谢激活因子(CAPCAP)结合区,)结合区,cAMPcAMP激活激活CAPCAP,CAPCAP结合结合启动子控制区,促进启动子控制区,促进PlacPlac介导的转录。葡介导的转录。葡萄糖代谢使萄糖代谢使cAMPcAMP
10、减少。因此基因工程上使减少。因此基因工程上使用的乳糖启动子抗葡萄糖代谢阻遏的突变用的乳糖启动子抗葡萄糖代谢阻遏的突变型,即型,即P PlaclacUV5UV5而在大规模培养重组大肠杆菌时,培养基中必须加而在大规模培养重组大肠杆菌时,培养基中必须加入葡萄糖,因此在实际操作中通常使用的是野生型入葡萄糖,因此在实际操作中通常使用的是野生型PlacPlac启动子的突变体启动子的突变体PlacUV5PlacUV5启动子。它含有一个启动子。它含有一个突变碱基对,其活性比野生型突变碱基对,其活性比野生型PlacPlac启动子更强,而启动子更强,而且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感,但且对葡萄糖及分解代
11、谢产物的阻遏作用不敏感,但仍为受体细胞中的仍为受体细胞中的LacLac阻遏蛋白阻遏,因此可以用阻遏蛋白阻遏,因此可以用乳糖或乳糖或IPTGIPTG进行有效诱导。人工构建的进行有效诱导。人工构建的PtacPtac启动子启动子由于含有由于含有laclac操作子区域,所以其阻遏诱导性质与操作子区域,所以其阻遏诱导性质与PlacUV5PlacUV5相同。相同。色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp的可控性的可控性P Ptrptrp受色氨酸受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏,阻遏蛋白复合物的阻遏,转录呈基底状态,在培养系统中去除色转录呈基底状态,在培养系统中去除色氨酸或加入氨酸或加入3-3-吲哚丙烯酸(
12、吲哚丙烯酸(IAAIAA)可有)可有效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨酸很难,基因工程通过添加酸很难,基因工程通过添加IAAIAA诱导诱导P Ptrptrp介导的目的基因的表达。介导的目的基因的表达。噬菌体启动子噬菌体启动子P PL L的可控性的可控性P PL L受阻遏蛋白阻遏,很难直接诱导,基因受阻遏蛋白阻遏,很难直接诱导,基因工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的cIcI突变基因突变基因cIcI857857控制控制P PL L,cIcI857857阻遏蛋白在阻遏蛋白在4242时失时失活脱落,活脱落,P PL L便可介导目的基因的表达,但便可介导目
13、的基因的表达,但在大型细菌培养罐中迅速升温很难,故常在大型细菌培养罐中迅速升温很难,故常使用双质粒的控制系统,用色氨酸间接控使用双质粒的控制系统,用色氨酸间接控制目的基因表达。制目的基因表达。当培养基中缺少色氨酸时,当培养基中缺少色氨酸时,PtrpPtrp启动子打开,启动子打开,CICI阻遏蛋白合成,由阻遏蛋白合成,由PlPl启动子介导的外源基因转录启动子介导的外源基因转录关闭;相反,当色氨酸大量存在时,关闭;相反,当色氨酸大量存在时,PtrpPtrp启动子启动子关闭,关闭,CICI阻遏蛋白不再合成,阻遏蛋白不再合成,PlPl启动子开放并激启动子开放并激活外源基因表达。从整体上来看,外源基因虽
14、然活外源基因表达。从整体上来看,外源基因虽然处于处于PlPl启动子控制之下,但却可用色氨酸取代温启动子控制之下,但却可用色氨酸取代温度进行诱导表达。度进行诱导表达。二二终止子终止子外源基因在强启动子的控制下表达,外源基因在强启动子的控制下表达,易发生转录过头现象,即易发生转录过头现象,即RNARNA聚合酶聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的近的DNADNA序列,形成长短不一的序列,形成长短不一的mRNAmRNA混合物。混合物。1.过长转录物的产生在很大程度上会过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,原因如下:影响外源基因的表达,原因如下:转录产物越长
15、,转录产物越长,RNARNA聚合酶转录一聚合酶转录一分子分子mRNAmRNA所需时间相应增加,外源所需时间相应增加,外源基因本身的转录效率下降;基因本身的转录效率下降;如外源基因下游紧接有载体上其它如外源基因下游紧接有载体上其它重要基因或重要基因或DNADNA功能区域,则功能区域,则RNARNA聚聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能,甚至导致重复制及其它生物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性;组质粒的不稳定性;过长的过长的mRNAmRNA往往产生大量无用往往产生大量无用的蛋白质,增加工程菌的能量的蛋白质,增加工程菌的能量消耗。消耗。过长的转录物往往不能
16、形成理想过长的转录物往往不能形成理想的二级结构,大大降低外源基因的二级结构,大大降低外源基因编码产物的翻译效率。编码产物的翻译效率。2.2.强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用目前常用的终止子来自于大肠杆菌目前常用的终止子来自于大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT1 1T T2 2以及以及T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T T,对于一些终止作用较弱的,对于一些终止作用较弱的终止子,通常采用二聚体终止子串联终止子,通常采用二聚体终止子串联的特殊结构,以增强其转录终止作用。的特殊结构,以增强其转录终止作用。终止子也可像启动子一样,通过特殊终止子也可像启动子一样,
17、通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNADNA中克隆筛选。中克隆筛选。3.3.终止子探针质粒终止子探针质粒pCP1pCP1可在可在AprApr的转化子中筛选对四环素敏感的重组克隆。的转化子中筛选对四环素敏感的重组克隆。三三核糖体结合位点核糖体结合位点1.外源基因在大肠杆菌中的高效表达外源基因在大肠杆菌中的高效表达取决于:取决于:转录启动频率转录启动频率mRNAmRNA的翻译起始效率:由其的翻译起始效率:由其55端端核糖体结合位点(核糖体结合位点(RBSRBS)的序列决)的序列决定定 2.2.RBSRBS序列的特征结构要素:序列的特征结构要素:位于翻译起始密码子
18、上游的位于翻译起始密码子上游的68个个核苷酸序列核苷酸序列5UAAGGAGG3(SD序列)序列)-16S rRNA翻译起始密码子翻译起始密码子SD序列与翻译起始密码子之间的距序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成离及碱基组成基因编码区基因编码区5端若干密码子的碱基端若干密码子的碱基序列序列3.3.SDSD序列的影响:序列的影响:取决于取决于SDSD序列与序列与16S 16S rRNArRNA的碱基互补性,的碱基互补性,其中其中GGAGGGAG四个碱基四个碱基序列尤为重要,其序列尤为重要,其中任一换成中任一换成C C或或T T均均会导致翻译效率大会导致翻译效率大幅度降低。幅度降低。mRNASm
19、all ribosomal subunit4.4.SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响:序列与起始密码子之间的序列的影响:SDSD序列下游若是序列下游若是AAAAAAAA或或UUUUUUUU翻译翻译效率最高。效率最高。CCCCCCCC或或GGGGGGGG的翻译效率分别是最的翻译效率分别是最高值的高值的50%50%和和25%25%。紧邻紧邻AUGAUG的前三个碱基成分对翻译的前三个碱基成分对翻译效率也很重要。如大肠杆菌效率也很重要。如大肠杆菌-半半乳糖苷酶的乳糖苷酶的mRNAmRNA:最佳碱基为:最佳碱基为UAUUAU或或CUUCUU,若用,若用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代
20、,取代,则酶的表达水平降为则酶的表达水平降为1/201/20。5.5.SDSD序列与起始密码子之间距离的影响:序列与起始密码子之间距离的影响:精确距离保证了精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体定位在核糖体定位后,翻译起始密码子正好处于核糖后,翻译起始密码子正好处于核糖体复合物结构中的体复合物结构中的P P位。多数情况下,位。多数情况下,它们之间为它们之间为7 7个碱基。个碱基。6.起始密码子及其后续密码子的影响:起始密码子及其后续密码子的影响:三个起始密码子:三个起始密码子:AUGAUG、GUGGUG、UUGUUG 识别频率:识别频率:GUG=50%AUGGUG=50%AUG UUG=25%
21、AUG UUG=25%AUG从起始密码子开始的前几个密码子从起始密码子开始的前几个密码子碱基要保证不与碱基要保证不与mRNAmRNA的的55端非编码端非编码区形成颈环结构,从而严重干扰区形成颈环结构,从而严重干扰mRNAmRNA在核糖体的准确定位。在核糖体的准确定位。四四密码子密码子1.1.生物体对密码子的偏爱性:不同生生物体对密码子的偏爱性:不同生物甚至是同种生物不同的蛋白编码物甚至是同种生物不同的蛋白编码基因,对于同一氨基酸所对应的简基因,对于同一氨基酸所对应的简并密码子,使用频率不同,即生物并密码子,使用频率不同,即生物体基因对简并密码子的选择具有一体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱
22、性。定的偏爱性。密码子的简并特性决定了来自不同生物因而密码子的简并特性决定了来自不同生物因而碱基组成也不同的基因组中,简并密码子出碱基组成也不同的基因组中,简并密码子出现的非随机性。在富含现的非随机性。在富含ATAT的生物(如单链的生物(如单链DNADNA噬菌体噬菌体X174X174)基因组中,密码子第三位上)基因组中,密码子第三位上的的U U和和A A出现的频率较高,而在出现的频率较高,而在GCGC丰富的生物丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G G或或C C的简并密码子占的简并密码子占90%90%以上的绝对优势。以上的绝对优势。2.密码子与反密码子
23、相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能在碱基含量没有显著差异的生物基因组中,在碱基含量没有显著差异的生物基因组中,简单密码子的使用频率可能是由密码子与简单密码子的使用频率可能是由密码子与反密码子的作用强度所决定的。适中的作反密码子的作用强度所决定的。适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行;弱配对作用可能使氨酰基行;弱配对作用可能使氨酰基tRNAtRNA分子进分子进入核糖体入核糖体A A位需要总费更多的时间;而强位需要总费更多的时间;而强配对作用则可能使转肽后核糖体在配对作用则可能使转肽后核糖体在P P位逐位逐出空载出空载tRNAtRNA分子
24、耗费更多的时间。分子耗费更多的时间。tRNAtRNA上反密码子的第一位碱基如果是修饰的上反密码子的第一位碱基如果是修饰的U U,则它与,则它与A A配对的机会多于配对的机会多于C C;如果是;如果是I I,则,则与与U U和和C C配对的频率高于配对的频率高于A A。反密码子第反密码子第1位碱基位碱基 密码子第密码子第3位碱基位碱基 A U C G G U,C U A,C I U,C,3.3.细胞内细胞内tRNAtRNA的含量的含量简并密码子的使用频率与相应简并密码子的使用频率与相应tRNAtRNA的丰度呈正的丰度呈正相关,通常,表达量较大的基因含有较少种类相关,通常,表达量较大的基因含有较少
25、种类的密码子,而且这些密码子又对应于含量高的的密码子,而且这些密码子又对应于含量高的tRNAtRNA分子,这样细胞便能以更快的速度合成需分子,这样细胞便能以更快的速度合成需求量大的蛋白质;而对于需求量少的蛋白质而求量大的蛋白质;而对于需求量少的蛋白质而言,其基因中含有较多与低丰度言,其基因中含有较多与低丰度tRNAtRNA相对应的相对应的密码子,用以控制该蛋白质的合成速度。密码子,用以控制该蛋白质的合成速度。4.密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响原核生物和真核生物基因组中密码原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异,两种策子的使用频率有较大差异,两种策
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