第六节-单链内切核酸酶课件.ppt

1、2023-5-131 小组成员：耿沙沙 赵彦朵朱新娅 王高伟基因工程2023-5-132 本节重点：1.S1核酸酶的活性和应用。2.Bal31核酸酶的活性和应用。3.脱氧核糖核酸酶（DNase)的活性和应用。2023-5-133一、S1核酸酶 S1核酸酶来源于米曲霉菌，是一种含锌的蛋白质，相对分子质量为32000，相对耐热，由nucO编码，该基因已被克隆。S1核酸酶是一种高度单链特异性的内切核酸酶，催化反应需要Zn2+和酸性条件，最佳pH4.04.5。2023-5-134 S1核酸酶的特性：（1）在高离子强度、pH4.2和1mmol/LZn2+存在的条件下，S1核酸酶可以高特异性地降解单链DN

2、A和RNA，包括双链分子中的单链区域（如发卡结构），反应产物为5单核苷酸。2023-5-135（2）调节S1核酸酶的用量，可以切割双链DNA的单链缺刻，但不能识别单个碱基 对的错配。（3）当S1核酸酶用量过大时，伴有双链核酸的降解，但该酶降解单链DNA的速度是降解双链DNA的75000倍。2023-5-1362023-5-137 S1核酸酶的应用：（1）可用于切掉DNA片段的单链突出末端以产生平末端；（2）打开双链cDNA合成中的发夹环结构；（3）S1核酸酶作图法在测定杂交核酸分子的杂交程度、RNA分子定位、确定内含子的位置、内含子和外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终止位点的测定中，S1核

3、酸酶都是十分有效的工具。2023-5-138 S1核酸酶的活性可被PO43-、5核苷、核苷三磷酸、枸橼酸盐和EDTA抑制。然而，其在低溶度的变性剂（如SDS、尿素甲酰胺）存在的条件下稳定。2023-5-139 二、Bal 31核酸酶 Bal 31核酸酶的特性：对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3-OH末端迅速降解DNA。对于线性双链DNA分子，它表现为35端的外切酶活性和53的外切酶活性，可有控制地从3末端和5末端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。（注意：Bal 31的3外切酶活性约为它的单链特异性内切酶活性的20倍）2023-5-1310 当底物是双链环形的DNA分子时，Ba

4、l 31的单链特异性内切核酸酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区的降解作用，将超螺旋的DNA切割成开环结构，进而成为线性双链DNA分子。除此以外，Bal 31核酸酶还可起到核糖核酸酶的作用，催化核糖体和tRNA的降解，但它不具有双链特异的核酸外切酶活性。2023-5-13112023-5-1312 Bal 31核酸酶的应用：Bal 31核酸酶降解DNA需要Ca2+的存在，在反应的不同阶段加入螯合剂EGTA（乙二醇双氨基乙醚四乙酸）可使反应终止。（1）用于确定DNA片段的限制酶图谱 使用Bal 31核酸酶降解待测DNA，在不同反应时间取出反应物，用EGTA溶液中止反应。然后，各样品用相应限制性内切

5、核酸酶消化后，可看到酶切片段按一定的顺序消失。2023-5-1313限制酶图谱就是一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。它实际上就是限制酶的特异切点在DNA上的定位，表现出一些部位的线性序列，它是DNA分子结构特异性的反映，所以限制酶图谱又称DNA的物理图谱。2023-5-1314（2）可用于在克隆前通过可控方式去除双链DNA末端不需要的序列。处理后的DNA末端，可用T4噬菌体DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段补平，再加入合成接头，插入适当载体。用此方法，还可以在DNA上生成一系列终点确定的缺失突变体。（3）用于确定DNA分子的二级结构2023-

6、5-13152023-5-1316 三、脱氧核糖核酸酶 脱氧核糖核酸酶简称DNA酶（DNase），是来源于牛胰脏的糖蛋白。它是一种需要二价阳离子的内切核酸酶，能从嘧啶核苷酸5端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5磷酸末端的寡核苷酸。当有Mg2+存在时，能在双链DNA上随机独立地产生切口；而在Mn2+存在时，则在双链DNA的大致同一位置上切割，产生平末端DNA片段。2023-5-1317 脱氧核糖核酸酶的应用：在分子克隆中，DNA酶主要用于：与大肠杆菌DNA聚合酶联合参与切口平移法标记DNA分子；在Mn2+存在下，随机裂解双链DNA分子，构建大片段插入的基因文库；用于DNase 足迹法分析DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点；使用无RNase的DNase 去除转录产物中的模板DNA。2023-5-1318