第六章-干细胞工程课件.ppt

1、干细胞干细胞（stem cell）:是具有自我更新、高度增殖和多项分是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细胞胞什么是干细胞什么是干细胞?骨髓干细胞神经干细胞神经干细胞 干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域，力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域，19991999年年干细胞研究被美国干细胞研究被美国科学科学杂志评为杂志评为19991999年度世界十大科学年度世界十大科学之冠，之冠，2000200

2、0年干细胞研究再次被年干细胞研究再次被科学科学杂志评为该年度世杂志评为该年度世界十大科学成就之一。界十大科学成就之一。组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方向。为干细胞应用的主要方向。干细胞有几个主要特征干细胞有几个主要特征干细胞本身不是终末分化细胞干细胞本身不是终末分化细胞干细胞能无限增殖分裂干细胞能无限增殖分裂干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态于静止状态干

3、细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保保持干细胞或分化为特定细胞持干细胞或分化为特定细胞干细胞的分类干细胞的分类按分化潜能大小来分类按分化潜能大小来分类:全能干细胞全能干细胞(Totipotent stem cell):它具有形成完整个体的它具有形成完整个体的 分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞多能干细胞多能干细胞(pluripotent stem cell):具有分化出多种组织细具有分化出多种组织细 胞胞的潜能，的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干

4、细胞是典型的例子，它到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞可分化出至少十二种血细胞 专能干细胞专能干细胞(multipotent stem cell):这类干细胞只能这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等根据来源来分根据来源来分:来源于胚胎来源于胚胎-胚胎干细胞胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell）胚胎生殖细胞胚胎生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell）来源于成体来源于成体

5、-成体组织来源的干细胞成体组织来源的干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell）根据干细胞组织发生的名称进行分类根据干细胞组织发生的名称进行分类:胎胎干细胞胎胎干细胞造血干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞成骨干细胞成骨干细胞内胚层干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞胰腺干细胞干细胞的转分化和去分化干细胞的转分化和去分化 1干细胞的转分化：干细胞的转分化：一种组织类型的干细胞在适当条件下分一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型的细胞的过程称干化为另一种组织类型的细胞的过程称干细胞的转分化。细胞的转分化。实验：实验：

6、C57BL/6J成年小鼠成年小鼠 造血造血干细胞干细胞 WBB6F/J-KitW/KitW-V鼠鼠(亚致死剂量同位素照射亚致死剂量同位素照射)在在鼠鼠的神经胶质细胞中检测到的神经胶质细胞中检测到Y染色体染色体.即即鼠的造血干细胞移植到造血干细胞移植到鼠鼠中分化为中分化为脑星形胶质细胞。脑星形胶质细胞。移植分离3天2干细胞去分化：干细胞去分化：一种干细胞向其前体细胞的逆向转化称一种干细胞向其前体细胞的逆向转化称干细胞去分化。干细胞去分化。实验：实验：成体鼠造血干细胞成体鼠造血干细胞 鼠卵泡的内细胞鼠卵泡的内细胞团团 表达胎鼠的珠蛋白基因表达胎鼠的珠蛋白基因参与胚胎造血系统的发育。参与胚胎造血系统

7、的发育。注入分化状态逆转3.干细胞的可塑性干细胞的可塑性(1)干细胞的横向分化干细胞的横向分化：在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为常分化为与其组织来源一致的细胞与其组织来源一致的细胞。但有。但有时供体干细胞会分化出时供体干细胞会分化出与其组织来源不一与其组织来源不一致的其它细胞致的其它细胞，这种现象称，这种现象称干细胞横向分干细胞横向分化化(trans-differentiation)。干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体中具有很强的可塑性。为干细胞治疗受体中具有很强的可塑性。为干细胞治疗提供了可能。提供了可

8、能。(2)实验实验：小鼠肌肉干细胞小鼠肌肉干细胞体外培养体外培养5天少量骨天少量骨髓间质细胞髓间质细胞 接受致死量辐射的小鼠接受致死量辐射的小鼠中中 各种血细胞系。各种血细胞系。植入分化 胚胎干细胞胚胎干细胞 当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。胚胎干细胞胚胎干细胞19811981年年EvansEvans和和KaufrnanKaufrnan及及Mar

9、tinMartin首次由小鼠中分离得到鼠首次由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。的胚胎干细胞。至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：金黄地鼠（金黄地鼠（1988）、貂（）、貂（1993）、猪（）、猪（1994，1997）、）、鸡（鸡（1996）、恒河猴（）、恒河猴（1995）、绒猴（）、绒猴（1996）分离得到人的胚胎干细胞（分离得到人的胚胎干细胞（1998）分离得到人的胚胎生殖细胞（分离得到人的胚胎生殖细胞（1998）人多能人多能(pluripotent)(pluripotent)干细胞：干细胞：James A.Thomson在 Wisconsin大学领导一个研究小

10、组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。方法：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面 marker 和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法，每个胚胎可取得1520个细胞用于培养。John D.Gearhart在 Johns Hopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。方法是：从受精后59周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordial germ cell)。由此培养的细胞株，证实具有全能干细胞的特征。人胚胎干细胞的获得人胚胎干细胞的获得(一)获得途径：获得途径：从早期胚胎获得从早期胚胎

11、获得 2.从原始生殖细胞获得从原始生殖细胞获得 3.从移植细胞从移植细胞(克隆细胞克隆细胞)获获得得 1从早期胚胎获得从早期胚胎获得 美国美国Thompson研究小组是从囊胚期胚胎研究小组是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞的内细胞团中获得胚胎干细胞：体外受精卵体外受精卵 囊胚期囊胚期 去除去除滋养层滋养层内细胞团内细胞团 得得5株干细胞系株干细胞系 32代代(8个月个月)保持未分化状态保持未分化状态。传代培养发育免疫切除法2从原始生殖细胞获得从原始生殖细胞获得gearhart小组：小组：流产胎儿性腺嵴流产胎儿性腺嵴 原始生殖细胞原始生殖细胞 获得获得5个多能干细胞系个多能干细胞系 7个月

12、不个月不分化分化。思路：原始生殖细胞是未分化细胞。思路：原始生殖细胞是未分化细胞。培养 分离培养3体细胞移植体细胞移植分化细胞核分化细胞核(乳腺、皮肤细胞乳腺、皮肤细胞)去核去核卵细胞卵细胞杂合细胞杂合细胞 发育成囊胚发育成囊胚 胚胎干细胞胚胎干细胞 成体成体(如多利羊如多利羊)。分离发育 移植 刺激 干细胞的体外培养干细胞的体外培养由于干细胞数目少，应用时需先在体外由于干细胞数目少，应用时需先在体外进行非分化性增殖，再进行诱导分化。进行非分化性增殖，再进行诱导分化。不同组织来源的干细胞的培养条件不尽不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同。相同。1 培养条件：培养条件：需要许多需要许多生长因子

13、生长因子和和间质细胞间质细胞共培养。共培养。如如Brustle等在体外培养了鼠的等在体外培养了鼠的ES细胞。细胞。分离分离ES细胞细胞 培养培养 培养培养 生长增殖生长增殖 保持分化潜能。保持分化潜能。停止供给生长因子，停止供给生长因子，ES细胞分化为寡树突细胞或细胞分化为寡树突细胞或星状细胞。星状细胞。EGF培养基FGF2+PDGFFGF2培养基2 分化诱导分化诱导在应用前还需依据靶组织类型对培养干细在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。胞进行定向分化诱导。分化诱导需了解：分化诱导需了解：干细胞发育有关的信号调节；干细胞发育有关的信号调节；干细胞发育的微环境。干细胞发育的微

14、环境。胚胎干细胞的分化潜能胚胎干细胞的分化潜能 胚胎干细胞是全能胚胎干细胞是全能(多能多能)性干细胞，具有性干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。分化为各种组织细胞的潜能。实验实验1：移植实验移植实验人胚胎干细胞人胚胎干细胞 小鼠体内小鼠体内 畸胎瘤畸胎瘤(良性良性)有三个胚层产生的组织：有三个胚层产生的组织：移植发育胃上皮胃上皮(内胚层内胚层)骨、软骨、平滑肌、横纹肌等骨、软骨、平滑肌、横纹肌等(中胚层中胚层)神经表皮、神经节复层磷状上皮等神经表皮、神经节复层磷状上皮等(外胚层外胚层)ESES细胞的体外定向诱导分化细胞的体外定向诱导分化原理：选择适当的诱导剂的诱导模式，通过诱导物与细胞表面受

15、体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化。ESES细胞的体外定向诱导分化细胞的体外定向诱导分化方法：经悬浮培养或悬滴培养，使ES细胞形成 EB(类胚体)，再将EB消化成单细胞贴壁培养，并于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养液或细胞因子等，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞，或培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。分化诱导分化诱导因素因素:化学诱导物化学诱导物(视黄酸、视黄酸、DMSO等）等）细胞因子（骨形成蛋白、视经生长因子等）细胞因子（骨形成蛋白、视经生长因子等）转录因子转录因子 (Oct-4等等）

16、诱导分化诱导分化方法方法:单层单层ES细胞诱导分化细胞诱导分化EB培养和诱导分化培养和诱导分化 ES细胞的生物学特性细胞的生物学特性 1.1.各种动物的各种动物的ESES细胞具有与早期胚胎细胞相似细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。仁。2.ES2.ES细胞与卵圆柱期（细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage）胚胎）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与ICMICM细胞有差异。细胞有差异。3.3.细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布细胞中多为常染色质，

17、胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常性质。正常ESES细胞染色体正常，如发生异常则其很细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。难发育分化形成动物个体。4.ES4.ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个单个ESES细胞和分化的扁平状上皮细胞。细胞和分化的扁平状上皮细胞。5.ES细胞增殖迅速，每细胞增殖迅速，每1824h分裂增分裂增

18、殖殖1次。次。6.此外，其还可以在体外进行选择、操此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征一个克隆的细胞具有同样的特征。ESES细胞生物学特性细胞生物学特性细胞形态结构及核型细胞形态结构及核型细胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达形态和生化特征形态和生化特征 1.形态形态：细胞体积小，核大，：细胞体积小，核大，1多个核多个核仁。离体培养可产

19、生密集的多细胞克隆。仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。2.生化特征生化特征：端粒酶活性高端粒酶活性高。3.干细胞物理特性干细胞物理特性：如 干 细 胞 对如 干 细 胞 对 H o e c h s t 3 3 3 2 4 和和Rhodamine123染料不着色。染料不着色。4.干细胞表面免疫原性干细胞表面免疫原性：一般表达胚胎：一般表达胚胎早期的表面抗原，而且有种属差异。早期的表面抗原，而且有种属差异。如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原原-1(SSEA-1)，不表达不表达SSEA-3或或SSEA-4；人胚胎干细胞表达人胚胎干细胞表达SSEA-3或或SS

20、EA-4。ES ES细胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能 ESES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点：显著特点：ESES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。2.2.在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：悬浮培养中：“简单类胚体简单类胚体”“囊状胚体囊状胚体”细胞分化物。细胞分化物。3.ES3.ES细胞可进行诱导分化细胞可进行诱导分化 *用用RA（维生素（维生素A

21、酸或视黄酸）作诱导酸或视黄酸）作诱导90以以上的上的ES细胞分化为神经胶质细胞，细胞分化为神经胶质细胞，*聚集培养的聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。律性收缩的心肌细胞。*将将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。个胚层细胞。*用用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。到可发育重构胚和动物个体。碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达 许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞许多资料表明，小鼠、大鼠

22、的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（均有碱性磷酸酶（AKPAKP）表达，小鼠的）表达，小鼠的ECEC细胞和细胞和ESES细胞中均细胞中均含有丰富的含有丰富的AKPAKP。而在已分化的。而在已分化的ECEC细胞和细胞和ESES细胞中细胞中AKPAKP呈弱呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKPAKP呈阳性。因此，呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定常用来作为鉴定EC细胞或细胞或ES细胞分化与否的标志之一细胞分化与否的标志之一。胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原早期胚胎细胞表面均表

23、达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA1）。在胚胎的原始外胚层细胞、）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、细胞、EC细胞细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA1的表达。小鼠的表达。小鼠SSEA1的表达自的表达自8一细胞期开始，直到原始外胚层形成期。一细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为也常作为ES细胞鉴定的一个标志。细胞鉴定的一个标志。胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定-细胞

24、的形态结构细胞的形态结构-核型分析核型分析-碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKPAKP）染色）染色-SSEA-I-SSEA-I 免疫荧光标记免疫荧光标记-分化能力检测分化能力检测 体外分化试验体外分化试验 体内分化试验体内分化试验 嵌合体形成试验嵌合体形成试验 核移植试验核移植试验ESES细胞形态学鉴定细胞形态学鉴定 依依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。细胞进行初步鉴定。核型分析核

25、型分析 ESES细胞具有正常二倍体核型，在体外培养条件下，稳定细胞细胞具有正常二倍体核型，在体外培养条件下，稳定细胞系的细胞染色体数目和核型保持与来源动物品系一致，系的细胞染色体数目和核型保持与来源动物品系一致，可用核可用核型分析进行检验。型分析进行检验。碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKP）染色）染色 *常用快绿（常用快绿（Fast Green Staining)Fast Green Staining)染色法，对照以已染色法，对照以已建系建系ESES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含作用液中不含-萘酚磷酸钠为阴性对照。萘酚磷酸钠

26、为阴性对照。*结果判定阳性对照结果判定阳性对照ESES细胞染成棕色，阴性对照无色。细胞染成棕色，阴性对照无色。小鼠小鼠3 35 5日龄胚胎日龄胚胎ICMICM为强阳性为强阳性。SSEA-I SSEA-I 免疫荧光标记免疫荧光标记 第第1 1抗体，抗体，SSEASSEA1 1（鼠抗（鼠抗ESES细胞单克隆抗体），细胞单克隆抗体），1:1001:100稀释；稀释；第第2 2抗体，羊抗鼠抗体，羊抗鼠 1 1：1010稀释稀释;封闭液，羊抗兔封闭液，羊抗兔lgGlgG。步骤：步骤：杜氏杜氏PBSPBS洗洗3 3次次,2,2TritonTriton作用作用20 min20 min；再以杜氏再以杜氏PBS

27、PBS洗洗3 3次次,封闭液中置封闭液中置20min20min；以杜氏以杜氏PBSPBS洗洗3 3次，加第次，加第1 1抗体于抗体于44过液；过液；以杜氏以杜氏PBSPBS洗洗3 3次，加第次，加第2 2抗体于抗体于3030温箱置温箱置30min30min；再以杜氏再以杜氏PBSPBS洗洗3 3次后用甘油次后用甘油PBSPBS封片。封片。样本在激光共聚焦图像系统下观察样本在激光共聚焦图像系统下观察,结果依细胞是否出现结果依细胞是否出现荧光作出判断。荧光作出判断。分化能力检测分化能力检测体外分化试验体外分化试验体内分化试验体内分化试验嵌合体形成嵌合体形成核移植核移植 胚胎干细胞（胚胎干细胞（em

28、bryonic stem cellembryonic stem cell，ESES细胞）也可被细胞）也可被称为多能干细胞（称为多能干细胞（pluripotent stem cellpluripotent stem cell，PSCPSC），是胚胎），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全能性的细胞。其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，能性的细胞。其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重

29、构等方面的研究将在未分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在未来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。目前胚胎干细胞的研究与应用目前胚胎干细胞的研究与应用51源于胚胎干细胞的细胞已能或可能治疗许多疾病神经细胞心肌细胞B型胰岛细胞软骨细胞白细胞皮肤细胞肝细胞骨细胞视细胞骨骼肌细胞帕金森病心肌梗死糖尿病骨关节炎白血病烧伤和创伤肝炎骨质疏松症视网膜退化肌营养不良治疗ESES研究面临的难题研究面临的难题（1 1）体外培养）体外

30、培养ES ES 细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。如何平衡这一对矛盾化状态。如何平衡这一对矛盾,必须筛选适宜的培养条件。必须筛选适宜的培养条件。目前在目前在ESES细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题,只在只在小鼠中建立了稳定的小鼠中建立了稳定的ESES细胞系，家畜、人类细胞系建立的最细胞系，家畜、人类细胞系建立的最佳条件仍无定论。佳条件仍无定论。（2 2）ES ES 细胞高度未分化细胞高度未分化,具有形成畸胎瘤的可能性具有形成畸胎瘤的可能性,因此在使因此在使用用ES ES 细胞进行治疗前必须首先体外诱导细胞

31、进行治疗前必须首先体外诱导ES ES 细胞分化产生某种特细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因异的组织细胞或设计自杀基因,当移植的细胞向肿瘤发展时当移植的细胞向肿瘤发展时,自自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导ESES细胞定向分化成细胞定向分化成单一类型的分化细胞单一类型的分化细胞,是至今仍未解决的难题。因此，必须寻找是至今仍未解决的难题。因此，必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组

32、织。（3 3）ESES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程,很多器官是两很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官自自然机体的器官,要离体培养并维持其正常的生理功能目要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到前还无法做到,器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。题。（4 4）最大的障碍来自于伦理学问题，特别是）最大的障碍来自于伦理学

33、问题，特别是ESES细胞应用受到细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类明令禁止进行人类ESES细胞研究。无论从基础研究角度来讲还细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类是从临床应用方面来看，人类ESES细胞带给人类的益处远远大细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，但随着观念的改变，人于在伦理方面可能造成的负面影响，但随着观念的改变，人们会逐渐认识到们会逐渐认识到ESES细胞对临床医学及生物学理论研究的重要细胞对临床医学及生物学理论研究的重要作用。作用。胚胎干细胞研

34、究的伦理挑战胚胎干细胞研究的伦理挑战 胚胎干细胞研究在伦理、道德和宗教方胚胎干细胞研究在伦理、道德和宗教方面遇到很大的障碍。面遇到很大的障碍。避孕、流产和体外授精在西方国家引起避孕、流产和体外授精在西方国家引起很大争议。很大争议。(一一)存在的问题存在的问题 1.胚胎干细胞的来源是否符合法律与道胚胎干细胞的来源是否符合法律与道德？德？2.胚胎干细胞的应用是否会引起伦理及法胚胎干细胞的应用是否会引起伦理及法律问题？律问题？3.该项研究是否会导致人流泛滥？或导致该项研究是否会导致人流泛滥？或导致医生刻意造成胚胎流产？医生刻意造成胚胎流产？4.如何看待克隆人的研究？如何看待克隆人的研究？（二）反对人

35、的观点（二）反对人的观点 1.认为胚胎干细胞研究破坏人类生命，认为胚胎干细胞研究破坏人类生命，其观念基于人类生命起始于早期胚胎。其观念基于人类生命起始于早期胚胎。2.天主教派极力反对胚胎干细胞研究，天主教派极力反对胚胎干细胞研究，认为用人类胚胎干细胞进行研究是一种认为用人类胚胎干细胞进行研究是一种“邪恶邪恶”。(三三)支持者的观点支持者的观点 科学界和病人组织强烈呼吁政府支持这项科学界和病人组织强烈呼吁政府支持这项研究。研究。2001年年4月，月，James Watson博士博士(DNA双螺旋结构发明人、冷泉港实验室主任双螺旋结构发明人、冷泉港实验室主任)倡导发起了由倡导发起了由80位诺贝尔奖

36、获得者参加位诺贝尔奖获得者参加的签名运动，呼吁政府支持干细胞研究。的签名运动，呼吁政府支持干细胞研究。(四四)西方政府的态度西方政府的态度 1美国总统布什美国总统布什(1)当选总统前反对，当选后出于政治目当选总统前反对，当选后出于政治目的，同意政府的，同意政府有限支持有限支持。2001年年8月月9日，布什作出决定，美国政日，布什作出决定，美国政府资助对府资助对2001年年8月月9日前日前得到的人体胚得到的人体胚胎干细胞研究，但胎干细胞研究，但不支持从新的胚胎中不支持从新的胚胎中获取干细胞获取干细胞的研究。的研究。(2)同时，布什提出成立一个由同时，布什提出成立一个由科学家、科学家、医生、伦理学

37、家、律师、神学家医生、伦理学家、律师、神学家等组成等组成的的总统生物伦理专家委员会总统生物伦理专家委员会，指导干细，指导干细胞的研究和管理。由芝加哥大学生物伦胞的研究和管理。由芝加哥大学生物伦理学教授理学教授Leon Kass担任主席。担任主席。(3)根据布什的决定，根据布什的决定，NIH对现存人体胚胎干对现存人体胚胎干细胞系进行登记，认定世界上有细胞系进行登记，认定世界上有64个人体胚胎个人体胚胎干细胞系干细胞系符合联邦政府资助的标准。符合联邦政府资助的标准。(4)64个人体胚胎干细胞系分布在个人体胚胎干细胞系分布在6个国家的个国家的10个机构个机构中：瑞典中：瑞典24个，美国个，美国20个

38、，印度个，印度10个，澳大利亚个，澳大利亚6个，以色列个，以色列4个。个。NIH试图用这些人体胚胎干细胞系完成有关人试图用这些人体胚胎干细胞系完成有关人体胚胎干细胞的基础研究工作。体胚胎干细胞的基础研究工作。3其他国家的态度其他国家的态度(1)德国禁止德国禁止利用人体胚胎干细胞进行研究。利用人体胚胎干细胞进行研究。(2)澳大利亚澳大利亚开始仿效美国的作法，开始仿效美国的作法，有限支持有限支持人人体胚胎干细胞的研究。体胚胎干细胞的研究。(3)法国、英国、日本法国、英国、日本允许利用允许利用多余的胚胎多余的胚胎和和SCNT技术创造的胚胎进行干细胞研究。技术创造的胚胎进行干细胞研究。成体干细胞是存在

39、于成体动物的许多组织和器官，具有修成体干细胞是存在于成体动物的许多组织和器官，具有修复和再生的能力的细胞。复和再生的能力的细胞。成体干细胞大多数时候处于静息状态。成体干细胞大多数时候处于静息状态。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞成体干细胞 （adult stem celladult stem cell，ASCASC）65成体干细胞的优点成体干细胞的优点 成体干细胞则可

40、从患者自身获得，不存在组织相容性成体干细胞则可从患者自身获得，不存在组织相容性的问题。的问题。成体干细胞不会诱发畸胎瘤的发生。成体干细胞不会诱发畸胎瘤的发生。成体干细胞也不存在伦理学争执成体干细胞也不存在伦理学争执。成体干细胞的不足成体干细胞的不足 尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞 .成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低龄增长而降低 在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植病人的干细胞中，这样的

41、干细胞不适于移植 成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力的增殖能力 由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的更多的DNADNA异常等。异常等。68胚胎干细胞和成体干细胞比较胚胎干细胞和成体干细胞比较胚胎干细胞成体干细胞来自胚泡的内细胞群来源于骨髓、外周血、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、齿髓、肝、皮肤、胃肠道粘膜层和胰腺等发育全能性，可诱导分化为机体分化较局限，部分成体干细胞（造血干细胞、

42、骨髓间充质干细胞、神经干细胞）有一定跨系、跨胚层的“可塑性”无限的自我更新能力病理条件下才显出一定的自我更新潜能增殖能力强，便于应用增殖能力较弱，故不能完全取代胚胎干细胞细胞可不断增殖，“永生化”，移植后有形成肿瘤的可能性成瘤的可能性很小不能自体移植自体移植可避免免疫排斥有伦理问题分离和使用不存在伦理问题成体干细胞的建系成体干细胞的建系l细胞系细胞系(cell line):指从原代培养物经传代培养后得来的一群不均一的细胞，可以长期连续传代l建系方法建系方法:将外源性端粒酶催化亚基基因，通过不同的方法导入成体干细胞，使其整合到基因组中并正常表达，从而维持或重建干细胞端粒酶的活性，建立起成体干细胞

43、系成体干细胞的可塑性成体干细胞的可塑性 通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化干细胞的横向分化 71间胚层组织类型干细胞转分化为同胚层另一组织类型细胞间胚层组织类型干细胞转分化为同胚层另一组织类型细胞间胚层组织类型干细胞转分化为内胚层组织类型细胞间胚层组织类型干细胞转分化为内胚层组织类型细胞间胚层组织类型干细胞转分化为外胚层组织类型细胞间

44、胚层组织类型干细胞转分化为外胚层组织类型细胞由此认为，成体干细胞有较大的可塑性由此认为，成体干细胞有较大的可塑性血细胞血细胞肌细胞肌细胞血细胞血细胞肝细胞肝细胞血细胞血细胞脑细胞脑细胞72研究还表明，骨髓来源的干细胞骨髓来源的干细胞在特定环境中可向肝脏、胰腺、肌肉及神经细胞分化；肌肉、神经干细胞也可向造血细胞分化。造血干细胞造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）既可分化为成熟的造血细胞，也可分化为成熟的皮肤表皮细胞、肺和胃肠道细胞73证实或推断：证实或推断：l在成体组织中仍然残留胚胎发育过程中各胚层定向和组织定向的各类干细胞。l在胚胎发育的各个阶段，有少部分干细胞

45、中止参与胚胎发育，并转入G0期。这些细胞既不增殖又不分化，仍然保持干细胞的基本特性。l出生后随年龄的增长，体内组织中保留的各类成体干细胞基本特征不变。但是，在体外一定细胞因子诱导刺激下，它可以从G0静止期转入细胞周期而增殖，并分化为某种组织定向细胞。74l组织干细胞分化的可塑性是很有限的，它只能沿着本组织各支系纵向分化（如造血干细胞的多向分化，仅限于髓系和淋巴系的造血细胞各支系的纵向分化），不能跨越本组织定向的限制，更不能突破胚层的界限。在生物界或人类医学史上也从未出现过因横向分化所至的疾病或怪胎。75l跨胚层转分化可能的原因是：骨髓中成体干细胞不仅包括造血干细胞，间质干细胞，而且还有其他各胚

46、层来源的干细胞及其分化的后代，即各类非造血组织的干细胞，如神经干细胞、肝脏干细胞等。l所谓成体干细胞多向分化的可塑性，其实是胚胎发育期存留于造血组织等部位的各胚层干细胞的自然属性，如肌肉匀浆中不仅含有肌细胞，脂肪组织中不仅含有脂肪细胞，其中还有各种成体干细胞，它们的分化过程并没有跨越组织定向的限制。76成体干细胞的应用成体干细胞的应用1999年，Science杂志编者Bloom：“干细胞给人类提供了极大的可能性：用干细胞修复病损的脏器和细胞缺损”，他还说“最终可能用干细胞制成像肾、肝这样复杂的器官”。77成体干细胞中，造血干细胞（包括骨髓、脐血和外周血中的干细胞）已用于治疗重度白血病和某些遗传

47、性血液病。78可经诱导向软骨细胞分化，并能分泌特异性型胶原基质，因此可望成为工程化软骨的种子细胞；分化为肌细胞，可能成为肌萎缩、肌营养不良时促进肌组织再生的靶细胞；骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）：79与基因治疗结合，可强化治疗效果，对某些基因突变所致的遗传性疾病；可分离其自体的间充质干细胞，体外进行改造，敲除突变基因，导入正常基因，然后重新输入体内，既纠正了遗传缺陷，又避免发生移植反应。80梗死的心脏注入富含鼠的骨髓干细胞后，40%的心肌层得到恢复。Olic.Nature.2001,410:701-705用人的骨髓来源的成骨干细胞使心肌梗死鼠30%40%

48、的心功能得到改善。Kocher.Nat Med.2001,7:430-436 81心脏有相当数量的干细胞，这些细胞可分化为心肌细胞，病理组织学观察显示，有0.015%的心肌细胞处于有丝分裂期，心肌梗死时为0.08%。Anversa.Nature.2002,415:240-243 82在性别不匹配的心脏移植中可见受者循环中的干细胞能移居并定位于移植的心脏，生成新的心肌纤维。Quain.N Engl.J.Med,2001,344(23):1750-175783新近的研究表明，成体非心脏来源的干细胞，如骨髓、脑、骨骼肌、脂肪组织、肝脏和外周血干细胞，通过自然迁移或实验植入心脏均可分化为心肌细胞，提示

49、成体干细胞可成为心肌梗死后再生的心肌细胞，目前已很快进入临床研究。84成体干细胞及其子代细胞移植或动员脑组织内的干细胞治疗神经退行性疾病已获初步成效。动物实验证实移植的神经元可替代修复已损坏的神经通路。临床试验也证实细胞替代治疗可使症状缓解。85帕金森病的主要病变是黑质纹状体中多巴胺能神经元的退行性变，给病人纹状体内移植胎儿中脑组织的结果显示，移植的神经元可以存活并恢复对纹状体的神经支配达10年。由于伦理、来源等问题，大量临床应用有困难。86用干细胞和生长因子修复骨折，可加速愈合。动物实验显示，从骨髓提取干细胞能改善治疗效果。用干细胞治疗瘫痪病人，已有成功病例的报告。分离出的毛囊干细胞与“诱导

50、”的真皮细胞结合可产生新的毛囊。87有人将干细胞当成“未来疾病治疗的新希望”；也有人怀疑“干细胞治疗：是新希望还是错误开端”，理由是不同的实验结果无法证实骨髓来源的单核细胞可分化为心肌细胞。88有些经冠脉注入自体骨髓细胞治疗心肌梗死的临床试验结果，初期显示功能改善，但以后与对照组无明显差别。经冠脉注入的骨髓源性单核细胞仅一小部分停留在心脏内，其疗效至今仍不能得出明确的结论。89将人胚胎干细胞注入患鼠大脑内帮助改善帕金森病症状，结果显示症状确有减轻，但与此同时，一些干细胞并不释放多巴胺，而是继续分裂，其生长方式类似早期的肿瘤细胞，最终可能会形成一种脑内肿瘤。90Bjklund和Svendsen以