第五章-遗传与变异课件.ppt

1、1 第五章第五章 病毒的遗传与变异病毒的遗传与变异生命科学与技术学院生命科学与技术学院 李李 灏灏 2种瓜得瓜，种豆得豆；种瓜得瓜，种豆得豆；龙生龙，凤生凤，老龙生龙，凤生凤，老鼠生仔会打洞。鼠生仔会打洞。遗传遗传一猪生九仔，连母十一猪生九仔，连母十个样。个样。变异变异3稳定性稳定性变异变异具有具有存在存在核酸核酸进化理论的发展进化理论的发展基因变异基因变异生物性状变化生物性状变化4病毒遗传的特点病毒遗传的特点1、遗传方式简单2、受宿主细胞影响3、易产生变异5nGenetics遗传:After virus replicates,the characters on the progeny vir

2、us are similar with the previous generation.nVariation变异:After virus replicates,the characters on the progeny virus are different with the previous generation.6第一节第一节 病毒变异的机制病毒变异的机制第二节第二节 病毒的突变病毒的突变第三节第三节 病毒的重组病毒的重组第四节第四节 影响病毒表型的病毒间相互作用影响病毒表型的病毒间相互作用第五节第五节 病毒基因图的构建方法病毒基因图的构建方法第六节第六节 病毒基因功能的研究方法病毒基因功

3、能的研究方法第七节第七节 哺乳动物病毒表达载体哺乳动物病毒表达载体7第一节第一节 病毒变异的机制病毒变异的机制nHeritable variation遗传型变异遗传型变异 因病毒遗传物质核酸发生了改变，导致其变异后的性状可遗传给子代病毒。包括突变（mutation）、重组（recombination）、重配（reassortment）、整合（integration）nNon-Heritable variation非遗传型变异非遗传型变异 又称基因产物的相互作用，因病毒核酸并未发生改变，所以此变异一般不能遗传。8非遗传型变异（非遗传型变异（Non-HNon-Heritableeritable v

4、ariation variation）Interactions：when two genetically distinct viruses infect a cell.4 different phenomena can ensue（1）Phenotypic mixing or transcapsidation 表型混合与核壳转移（2）genotype mixing 基因型混合（3）enhancement 增强（4）complementation 互补9第二节第二节 病毒的突变病毒的突变一、突变的定义二、突变的机制三、病毒突变类型四、病毒突变体10一、突变的定义一、突变的定义n基因突变指细胞内（

5、或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，简称突变，狭义的突变专指基因突变，广义的突变包括基因突变和染色体畸变。n病毒突变：病毒遗传物质核酸的组成或结构发生改变称为突变。11病毒突变研究中广泛使用的术语病毒突变研究中广泛使用的术语n株 strain：用来区分同一病毒的不同野生型n型 type：血清型的同义语n突变株 mutant：一般突变株指的是因基因改变而发生某些生物特性改变的病毒株。n变异株 variant：当病毒突变株能较稳定的存在，并可在相应的宿主或细胞中传代与存活，则称为变异株。12 二、突变的机制二、突变的机制 自发性突变(复制中的损伤、碱基的自发性化学改变、自发

6、脱碱基、细胞的代谢产物对DNA的损伤)物理因素引起的突变(电离辐射、紫外线、热诱变等)化学因素引起的突变（烷化剂、碱基类似物、嵌入试剂等）13突变的原因突变的原因诱因物理因素：化学因素：如X射线、激光等亚硝酸、硫酸二乙酯、二口恶口英、秋水仙素等在没有这些外来因素影响时，基因突变也会由于DNA分子复制偶尔发生错误，DNA的碱基组成发生改变等原因发生自发改变。外因内因相互作用141 1、自发突变（、自发突变（spontaneous mutationspontaneous mutation）nDNA病毒自发突变率较低，一般在10-8-10-11。nRNA病毒自发突变率远高于DNA病毒，可达10-3-

7、10-4。15HIVHIV的变异的变异变异变异变异变异HIV基因组可发生变异，最易变异的是编码包膜糖蛋白的env基因和调节基因nef。env基因核苷酸变异概率每年每个位点0.1%，其变异率与流感病毒相似。根据nef基因序列的异同，将HIV-1分M、O、N等3组（group）12个亚型(subtype)；HIV-2分为A-F等6个亚型。gp120 gp4116HIVHIV感染者体内的病毒群感染者体内的病毒群A quasispecies(准病毒群)是从感染病毒遗传变异而来不同病毒株准病毒群的产生是由于逆转录酶的错误编码突变率：10-3-10-5/碱基/复制周期 HIV 每天有109-1010 复制

8、周期 每个碱基每天均可能突变1 次17HIVHIV快速复制的结局快速复制的结局 HIV 病毒株变异的结果：抗免疫识别 抗未来疫苗诱导的免疫力 更适于复制 更具致病力 更易持续 更易于传播 不同的细胞嗜性突变-多样化-进化18HIVHIV变异性变异性19The transmission route of HIV-1 in The transmission route of HIV-1 in ChinaChinaSHANXIFUJIANXIZHANGHEILONGJIANGJILINLIAONINGNEIMENGGUBeijingTian JinQINGHAIHEBEININGXIAGANSUSH

9、AN XIANHUIHENANSHANDONGShang HaiJIANGXIHUBEIJIANGSUHUNANGUANGDONGGUANGXIGUIZHOUHAINANYUNNANSICHUANTAIWANXINJIANGChong QingZHEJIANGCRF07-BCBCRF01-AEB传入我国C传入我国CRF08-BC20n各种物理、化学诱变剂（Mutagens）可提高病毒突变率，如温度、射线、5-溴尿嘧啶、亚硝酸盐等物理、化学因素的作用均可诱发突变。n运用特定诱变剂处理病毒，已成为获得适当病毒突变体的有效途径。n体外诱变剂。体外诱变剂。对病毒的静态核苷酸进行化学修饰，使其在后面的复

10、制中碱基配对发生改变，这类诱变剂主要包括亚硝酸、羟胺、烷化剂等。n体内诱变剂。体内诱变剂。诱变复制过程中的病毒。包括碱基类似物、插入剂等。2 2、诱发突变（、诱发突变（induced mutationinduced mutation）21n突变株与原先的野生型病毒特性不同，表现为病毒毒力、抗原组成、温度和宿主范围等方面的改变。n根据遗传信息的改变分类：同义突变、错义突变、无义突变、连续突变。n根据突变方向分类：正向突变、回复突变。n根据突变点位置分类：组成型突变、启动子上升突变、启动子下降突变、抗阻遏突变、抗反馈突变。n根据突变表型分类：形态突变体、条件致死突变体、生化突变体等。三、病毒突变的

11、类型三、病毒突变的类型221、无效突变体（、无效突变体（null mutant）：病毒的一个基因完全 失活。主要用于确定病毒的必需基因。2、条件致死突变体（条件致死突变体（conditional lethal mutants）：）：指病毒突变后在特定条件下能生长，而在原来条件下不能 繁殖而被致死。n温度敏感条件致死突变株，简称温度敏感突变体温度敏感突变体（temperature-sensitive mutant,ts），在特定温度（2835）（允许温度）下孵育则能增殖，在非特定温度（3740）（非允许温度）下孵育则不能繁殖，而野生型在两种温度均能增殖。四、病毒突变体四、病毒突变体23温度敏感突

12、变体特性温度敏感突变体特性nts突变体一般产生全长蛋白质，它与野生型蛋白抗原特异性相同；n一些ts突变体是渗漏突变，在非允许条件下可以保留非常弱的活性功能，产生很少的感染性病毒；n在允许条件下，ts突变体很难达到野生型那样有效的功能。这也就是说，ts突变体是一个弱毒株；n在一个给定的基因中，ts突变能产生不同的表型，用来帮助鉴定特异性功能位点和区域。243、蚀斑突变体（、蚀斑突变体（plaque morphology mutant）：由于突变体和野生型病毒代谢不同，蚀斑突变体可产生 大小和形状不同于野生型的蚀斑。蚀斑突变体表型能提 供有用的遗传学标记。4、宿主范围突变体（、宿主范围突变体（ho

13、st range mutant）：例如 狂犬病毒突变株适应在兔脑内增殖，由“街毒”（street virus）变为“固定毒”（fixed virus），可制成狂犬病疫 苗。街毒：从人和自然感染的动物中分离并存在于自然界中 的野生毒株称为街毒。固定毒：将街毒株在家兔等实验动物脑内接种，并连续 传代50代以上而获得的脑内潜伏期短且固定的病毒称为 固定毒株。255、抗药性突变体（、抗药性突变体（drug resistance mutant）：可 作为病毒遗传学研究的工具。用于验证特异基因功能或 验证蛋白质特异部分的功能，可用来阐明病毒的重组机 制等基本遗传学问题。6、抗原突变体（、抗原突变体（ant

14、ibody resistance mutant）：病毒的抗原性由病毒表面蛋白质的抗原决定簇决定，抗 原结构变异导致抗原性产生差别。7、回复突变体（、回复突变体（revertant）真正的回复突变 假回复突变：基因内阻抑、基因外阻抑 26突变株（突变株（mutant）：）：因基因改变而发生某些生物特性改变的病毒株。变异株（变异株（variant)：当该突变株能较稳定地存在，并可在相应的宿主或细胞中传代与存活，则称为变异株。由于病毒群体中常同时存在基因组略有不同的病毒体，因此在研究中常利用病毒稀释后在单层细胞形成空斑，经三次纯化而获得纯度高的毒株。27（+）3，5 5，3，5，RNADNA多聚酶多

15、聚酶PC（-）Pre CPreS1PreS2SXHBV基因结构及其突变基因结构及其突变HBsAg编码编码DNA多聚酶多聚酶HBcAgHBeAg 编码编码HBxAg28第三节第三节 病毒的重组病毒的重组一、病毒重组机制二、病毒基因重组的方式三、病毒重组的意义29一、病毒重组机制一、病毒重组机制n当二种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为病毒基因重组。n根据对DNA序列和所需蛋白质因子的需要，重组分为：同源重组（一般重组）位点专一性重组30ABababABaBAb基因组不分节段的病毒的重组基因组不分节段的病毒的重组31分节段基因组病

16、毒的基因重组（交换基因节段）称重配（reassortment）。发生几率较高。32二、病毒基因重组的方式二、病毒基因重组的方式n两种活性（感染性）病毒之间：如流感病毒n活性与非活性病毒之间（交叉复活，cross reactivation）n两种非活性病毒之间（多重复活，multiplicity reactivation）：如紫外线照射后n病毒与宿主细胞之间（不产生病毒后代，但致宿主细胞恶变）33 活病毒间的重组活病毒间的重组 例如流感病毒两个亚型例如流感病毒两个亚型 之间可基因重组，产生之间可基因重组，产生 新的杂交株，即具有一新的杂交株，即具有一 个亲代的血凝素和另一个亲代的血凝素和另一 亲

17、代的神经氨酸酶。这亲代的神经氨酸酶。这 在探索自然病毒变异原在探索自然病毒变异原 理中具有重要意义。流理中具有重要意义。流 感每隔十年左右引起一感每隔十年左右引起一 次世界性大流行，可能次世界性大流行，可能 是由于人的流感病毒与是由于人的流感病毒与 某些动物（鸡、马、猪）某些动物（鸡、马、猪）的流感病毒间发生基因的流感病毒间发生基因 重组所致。重组所致。34禽流感变异禽流感变异n甲型流感病毒的遗传变异。流感病毒的基因组由8个单链的RNA片段组成。病毒增殖基因重配抗原性和致病性变异。HA抗原性变异率最高，其次是NA。这两种抗原变异可独立发生，有时两个同时发生变异。抗原变异分为抗原漂移(Antig

18、enic drift)和抗原转移(Antigenic shift)。35抗原漂移和抗原转移模型抗原漂移和抗原转移模型shiftdrift由于点突变而引起流感病毒的抗原性逐渐发生变异称为抗抗原漂移原漂移。由于基因重组导致的变异则称为抗原转移抗原转移。36抗原转移抗原转移3738甲型甲型H1NIH1NI流感（猪流感）流感（猪流感）39 死死 活活 病病 毒毒 间间 的的 重重 组组 例如将能在鸡胚中生长良好的甲型流例如将能在鸡胚中生长良好的甲型流 感病毒（感病毒（A0或或A1亚型）疫苗株经紫外亚型）疫苗株经紫外 线灭活后，再加亚洲甲型（线灭活后，再加亚洲甲型（A2亚型）亚型）活流感病毒一同培养，产

19、生出具有前活流感病毒一同培养，产生出具有前 者特点的者特点的A2亚型流感病毒，可供制作亚型流感病毒，可供制作 疫苗，此称为交叉复活疫苗，此称为交叉复活(Cross reactivation)40n当一个细胞被多个病毒同时感染，即发生复合感染时，其中若有不能单独启动繁殖循环的灭活病毒颗粒存在，由于灭活病毒与参与复合感染的有活力的病毒间发生重组，或灭活病毒之间彼此重组，从而产生有感染性的重组子代病毒，这种现象称为复活复活（reactivation），这是一种特殊的病毒重组现象。n一株活性病毒与另一株相关但具有不同遗传标记的灭活病毒复合感染细胞，由于重组产生具有灭活病毒某些遗传标记的活性病毒重组体，

20、这类病毒复活现象称为交叉复活交叉复活（cross reactivation），又称为标记拯救（marker rescue）。n利用交叉复活可以选择性地获得具有所需性状的病毒重组体；n交叉复活可用于构建病毒DNA的遗传图谱；n利用标记拯救技术构建病毒表达载体。41 灭灭 活活 病病 毒毒 间间 的的 重重 组组灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体，此称为多重复活（体，此称为多重复活（Multiplicity reactivation），这是因为两种病毒核酸），这是因为两种病毒核酸上受损害

21、的基因部位不同，由于重组合相上受损害的基因部位不同，由于重组合相互弥补而得到复活。互弥补而得到复活。因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，以防病毒复活的危险。以防病毒复活的危险。42三、病毒重组的意义三、病毒重组的意义n产生具有双亲表型特性的重组病毒；n逃避免疫；n非活性病毒产生有活性的后代；n致宿主细胞恶变。43第四节第四节 影响病毒表型的影响病毒表型的病毒间相互作用病毒间相互作用n表型混合（phenotype mixing）：病毒混合感染产生一种具有两个亲代病毒结构蛋白（壳体或囊膜）的子代，这种现象称表型混合。病毒的表型变异，但不遗传。表型混合的一种极端情

22、况是转壳现象。n基因型混合（genotype mixing）：二种病毒的核酸在同一病毒的外壳内或二种病毒核壳体在同一包膜内，也无遗传性。n互补（complementation）：指两种病毒通过产生基因产物相互间补充不足，如缺损病毒与辅助病毒。n增强（enhancement）：当两种病毒混合培养时，一种病毒促进、增高另一种病毒的产量，其机理是通过抑制干扰素的产生。n多倍体（polypoidy）：是病毒成熟过程中，出现数个核衣壳被一个囊膜包裹的现象，多见于副粘病毒。44一、一、表型混合表型混合n两株病毒混合感染时，装配过程发生错误形成n主要表现为耐药性、抗原性等改变，基因并未改变，改变的生物学性状

23、不能遗传virus Avirus Bphenotypemixing virus Avirus B45表型混合和核壳转移表型混合和核壳转移 46n互补是两种病毒混合感染时，由于一种病毒为另一种病毒提供了其必需但又缺陷的基因产物，从而促进其增殖，或者两种病毒互为对方提供了所必需的基因产物，使双方的增殖均有所促进。n互补特性：互补特性：n在互补过程中，感染病毒的基因型都没有改变，所产生子代只获得其它病毒编码蛋白，但其基因组与亲代病毒相同；n在互补实验中，若两个病毒缺少相同的基因产物，没有一个亲代能提供缺失的功能，亲代间没有任何互补发生。n根据互补的这些特性，能确定病毒突变体的不同功能组。二、互补二、

24、互补47互补互补注意区分互补与多重复活481表型混合表型混合(Phenotype mixing)两种病毒混合感染后，一个病毒的基因组偶而两种病毒混合感染后，一个病毒的基因组偶而装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病毒成分装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病毒成分构成的衣壳内，发生表型混合。这种混合是不构成的衣壳内，发生表型混合。这种混合是不稳定的，传代后可恢复其原来的特性。稳定的，传代后可恢复其原来的特性。2基因型混合基因型混合(Genotype mixing)3互补互补(Complementation)4增强增强(Enhancement)5.多倍体多倍体（polypoidy）指两种病毒的核酸偶而混

25、合装在同一病毒衣壳指两种病毒的核酸偶而混合装在同一病毒衣壳内，或两种病毒的核衣壳偶尔包在一个囊膜内，内，或两种病毒的核衣壳偶尔包在一个囊膜内，但它们的核酸都未重组合，所以没有遗传性。但它们的核酸都未重组合，所以没有遗传性。指两种病毒通过其产生的蛋白质产物（如酶、指两种病毒通过其产生的蛋白质产物（如酶、衣壳或囊膜）相互间补助不足，例如辅助病衣壳或囊膜）相互间补助不足，例如辅助病毒与缺损病毒间、两个缺损病毒间、活病毒毒与缺损病毒间、两个缺损病毒间、活病毒与死病毒间都可以互补，互补后仍产生原来与死病毒间都可以互补，互补后仍产生原来病毒的子代病毒的子代 指两种病毒混合培养时，一种病毒能促进增强另指两种

26、病毒混合培养时，一种病毒能促进增强另一种病毒的产量，可能是因为前者压制了产生干一种病毒的产量，可能是因为前者压制了产生干扰素所致扰素所致是病毒成熟过程中，出现数个核衣壳被一个是病毒成熟过程中，出现数个核衣壳被一个囊膜包裹的现象，多见于副粘病毒囊膜包裹的现象，多见于副粘病毒 49三、病毒变异的实际意义三、病毒变异的实际意义1研制减毒活疫苗。如Ts株、宿主适应性突变株的研制。2应用于基因工程（Genetic engineering）基因工程是将一个生物体的基因，也就是携带遗传信息的DNA片段，转移到另一个生物体内，与原有生物体的DNA结合，实现遗传性状的转移和重新组合，从而使人们能够定向地控制、干

27、预和改变生物体的变异和遗传。如何利用病毒突变和重组建立病毒生物学研究的有效方法，如何利用重组病毒构建重要疾病基因治疗载体，是研究病毒遗传和变异的主要目的之一。虽然有一些病毒现已可通过序列分析进行其基因组研究，但病毒重组作图、重配作图、中间型杂交、转录图和多肽图等仍是研究病毒遗传图的重要方法。在病毒基因功能研究中，经典的互补试验、克隆基因的互补试验以及利用突变和重组进行的顺式因子分析、反式因子分析和基因瞬时表达，都有着不可替代的作用。由于一些病毒可以感染人类和动物的特异组织细胞，利用这些病毒构建表达外源基因载体，用于人类一些特殊疾病的基因治疗，这一方面具有诱人的前景。50四、减毒活疫苗四、减毒活

28、疫苗（Attenuated Vaccines）51繁殖快，生长迅速繁殖快，生长迅速1 1、减毒活疫苗减毒活疫苗 Attenuated VaccinesAttenuated Vaccines鸡胚鸡胚培养细胞培养细胞大量突变病毒大量突变病毒原代猴肾细胞原代猴肾细胞减毒减毒生长迅速，无毒性，只在非神经组织（non-nervous）中生长（肾），不在CNS生长Sabin 疫苗疫苗Sabin polio vaccine传代病毒于其他宿主传代病毒于其他宿主（foreign host）522 2、SabinSabin疫苗疫苗减毒的分子基础减毒的分子基础温度敏感温度敏感 temperature sensiti

29、vegrow better at 25-32 degrees than 37 degrees冷适应冷适应cold adaptedgrow as low as 25 degrees脊髓灰质炎脊髓灰质炎I I型减毒疫苗型减毒疫苗基因组基因组5757个碱基改变个碱基改变2121个氨基酸改变个氨基酸改变减毒疫苗是由病毒表面减毒疫苗是由病毒表面蛋白发生改变产生的蛋白发生改变产生的 53Sabin 脊髓灰质炎疫苗三种（型）减毒脊髓灰质炎病毒糖丸（糖浆）口服sIgATh巨噬细胞IgAsIgA浆细胞BM细胞上皮细胞辅助野型病毒543、流感病毒疫苗、流感病毒疫苗减毒的分子基础减毒的分子基础减毒鼻疫苗减毒鼻疫苗a

30、ttenuated nasal vaccine冷适应疫苗冷适应疫苗cold-adapted vaccineculture cells渐进性低温传代渐进性低温传代12代，或12代以上只在只在25C生长良好生长良好限制病毒在上呼吸道限制病毒在上呼吸道流感病毒流感病毒 influenza virus55 用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）突变并经过筛选温度敏感而获得的流感病毒A和RSV温度敏感突变株（Temperature-sensitive mutants）.在流感发病过程中，TS基因（TS gene）可在实验室进行重配，产生一株病毒，可作为流感病毒新疫苗，它具有现在流行株的外壳，和减

31、毒株的内部蛋白。New methods of vaccine productionNew methods of vaccine production*基因重配基因重配56Attenuated influenza vaccine strain using a cold-sensitive mutant that can be reassorted with new virulent strains NA：神经氨酸酶：神经氨酸酶HA：血凝素：血凝素（中和抗体的靶位）（中和抗体的靶位）57减毒株减毒株新的毒株（流行株）新的毒株（流行株）重重配配病毒病毒（新疫苗）（新疫苗）基因重配基因重配584 4、

32、Advantages of attenuated vaccinesAdvantages of attenuated vaccines1)激活免疫系统的所有时相。可产生体液IgG和局部IgA。2)对所有保护性抗原均产生免疫应答，不同于抗原性发生改变 的死疫苗。3)免疫性持久，交叉反应多4)成本低5)在大多数的疫苗接种者中可迅速产生免疫性6)接种方便，如 polio and adenovirus vaccines7)可在某一群体内消除野生型病毒591)突变，复毒 2）保存与运输均需冷藏3)扩散到其他没有接种的人4)扩散未标化的疫苗5)很难传入到热带地区 6)对免疫缺陷病无能为力5 5、Disadv

33、antages of Attenuated vaccineDisadvantages of Attenuated vaccine60全球脊灰野病毒病例的分布(1988-2004年)1988 350,000例 125个流行国家 2003784例6个流行国家20041,268例6个流行国家6 6、减毒活疫苗的突变复毒、减毒活疫苗的突变复毒61脊灰疫苗衍生病毒脊灰疫苗衍生病毒（Vaccine Derived Polio Virus,VDPVVaccine Derived Polio Virus,VDPV）Structural RegionNon-structural RegionP1P2P33 NT

34、R5 NTRAnVPg IRES2A2B2C3C3D3A1D1C1B1AVPgAACLOVER -LEAFu 在VP1段(900-906个碱基)的核苷酸与疫苗株差异1-15%；u 能够导致人与人之间的传播；致病性较强；u 在生物学性状上很难与脊灰野病毒区分；u VDPV可在低OPV覆盖率地区长时间循环，引起脊灰暴发62VDPVVDPV的产生过程的产生过程口服OPV 机体内病毒复制时核苷酸变异 病毒由粪便排出体外 再感染敏感机体 机体内病毒进一步变异 VDPV产生631)产生充分的体液免疫2)不出现突变和复毒 3)可用于免疫缺陷的病人 4)一般在热带地区活性不受影响5)便于保存与运输Advant

35、ages of inactivated vaccine7 7、inactivated Vaccinesinactivated Vaccines641)许多接种者不产生免疫反应 2)需要多次免疫3)无局部免疫4)成本高 5)猴子短缺 6)灭活失败，接种病毒的毒株 Disadvantages of inactivated vaccines65第五节第五节 病毒基因图的构建方法病毒基因图的构建方法一、遗传学方法二、分子生物学方法66一、遗传学方法一、遗传学方法1、重组作图（recombination mapping）2、重配作图（reassortant mapping）3、中间型杂交（interty

36、pe cross）671、重组作图、重组作图n基本原理：当两株带有不同标记的病毒突变体感染同一细胞培养物时，其标记基因的位置越接近，突变体经过交换产生的病毒重组体频率越低。n在单一分子病毒基因组中，重组通过断裂与重接机制或拷贝选择机制进行，两个突变体间的重组频率与其在染色体上的物理距离成比例。n在具分段基因组的病毒中，当突变体成对杂交时，子代重组率要么非常高，要么检测不到，呈现一种有或无的类型。682 2、重配作图、重配作图3 3、中间型杂交、中间型杂交n遗传学研究中经常用一个病毒的不同血清型或株系作为杂交的样本，血清型和株系比突变体提供了更多的遗传标记。n核酸的电泳迁移率经常作为血清型或株系

37、的遗传学标记。在分段基因组病毒中，病毒基因组片段迁移率的多型性也可作为亲代的遗传学标记。694 4、重组作图、重组作图噬菌体的重组测验噬菌体的重组测验1）对性状的理解（噬菌斑？）噬菌斑形态突变型：rr型 清晰、大噬菌斑浑浊、小噬菌斑 宿主范围突变型：hh型 (侵染、侵染后均可)交换是发生在DNA分子间702 2）T4T4噬菌体野生型和几种突变型的区别噬菌体野生型和几种突变型的区别噬菌体类型 不同大肠杆菌菌斑平板 E.coli B E.coli K()E.coli S野生型 小噬菌斑 小噬菌斑 小噬菌斑rI 大噬菌斑 大噬菌斑 大噬菌斑 rII 大噬菌斑 无噬菌斑（致死）小噬菌斑rIII 大噬菌

38、斑 小噬菌斑 小噬菌斑rII:r47 +,+r104 (+,r47r104,r47+,+r104)713 3）T4T4噬菌体共侵染噬菌体共侵染=E.coli Br47 +r104 E.coli B E.coli K()野生型野生型 小噬菌斑小噬菌斑 小噬菌斑小噬菌斑rII 大噬菌斑大噬菌斑 无噬菌斑（致死）无噬菌斑（致死）rII:r47 +,+r104 (+,r47 r104,r47+,+r104)E.coli B 3456E.coli K()45724 4）T4T4噬菌体突变型的重组测验噬菌体突变型的重组测验Benzer的重组测验与基因的精细结构分析的重组测验与基因的精细结构分析噬菌体杂交实

39、验 r47r+r+r104 B B K()r r+r r+亲组合：r47r+、r+r104重组合：r+r+、r47r10473重组值的计算重组值的计算100%重组率重组型噬菌斑数总噬菌斑数 E.coli()45 2 E.coli B 3456 100%1.33%74755）利用这种方法测得最小重组率的意义）利用这种方法测得最小重组率的意义测得最小重组值=0.02%=0.02cM T4噬菌体图距=1500cM(遗传重组测得)T4噬菌体1.8 105bp(生物化学及分子生物学测得)重组作图的精度：0.02cM=2-3bp=1.8 105bp/1500cM 0.02cM766 6）T2T2噬菌体的两

40、点测交与重组作图噬菌体的两点测交与重组作图 T2突变型（r-）：快速溶菌型，产生大而界限清晰的噬菌斑；T2野生型（r+）：缓慢溶菌型，产生小而边缘模糊的噬菌斑。T2寄主范围突变型（h-）：能感染大肠杆菌品系1和品系2，产生透明的噬菌斑。T2野生型（h+）：只能感染品系1，因为品系2的细胞表面能阻止T2噬菌体对它的吸附。T2T2噬菌体的突变型噬菌体的突变型77E.coli 1 和和 2T2T2噬菌体的杂交噬菌体的杂交 h+r-h-r+E.coli 1基因型 表现型 h-r+亲组合 透明,小 h+r-亲组合 半透明,大 h-r-重组合 透明,大 h+r+重组合 半透明,小 78重组噬菌斑数 (h+

41、r+)+(h-r-)重组值=100%噬菌斑总数 噬菌斑总数 T2T2噬菌体的重组值的计算噬菌体的重组值的计算杂交组合噬菌斑基因型的%重组值h+r-h-r+h+r+h-r-h+ra-h-ra+34.042.012.012.024%h+rb-h-rb+32.056.06.06.012%h+rc-h-rc+39.059.00.70.91.6%79 则：则：rara、rbrb、rcrc与与 h h之间的顺序：之间的顺序：ra 24 hrb 12 hrc 1.6 h 4个基因可能的排列：个基因可能的排列：ra rb rc h ra rc h rb ra rb h rcra h rc rb80二、分子生物

42、学方法二、分子生物学方法1、序列分析（sequence analysis）由病毒DNA序列可预测开放阅读框（open reading frame,ORF）；当预测的蛋白编码序列与一个已知功能的蛋白序列相似 时，可假设预测蛋白的功能；根据DNA序列可确定作为基因表达信号的短序列基元。2、转录图和多肽图81第五节第五节 病毒基因功能的研究方法病毒基因功能的研究方法一、互补二、利用分离基因研究病毒基因功能的方法821、噬菌体的突变型的互补试验、噬菌体的突变型的互补试验互补试验互补试验：根据基因的功能确定两个基因是否等位的测验方法，确定突变的功能关系。互补作用互补作用：两个突变型的两条同源染色体同处在

43、一个杂合子时，野生型基因补偿突变基因的缺陷而使表型恢复正常。否则，两种突变型一定具有相同的功能损伤。一、互补一、互补831 1）X X174174条件致死突变型的互补试验条件致死突变型的互补试验互补试验原理互补试验原理在限制条件下，能长出噬菌斑：说明：两个突变型能发生功能互补，是两个基因。在限制条件下，不能长出噬菌斑：说明：两个突变型不能发生功能互补，是同一基因。84 互补试验结果互补试验结果X174突变的互补试验结果顺反子 突 变 型A am8,am18,am30,am33,am35,am50,am86,tsl28 B am14,am16,och5,ts9,tsl16,och1,och8,o

44、ch11C och6D am10,amH81E am3,am6,am27F am87,am88,am89,amH57,op6,op9,tsh6,ts41D G am9,am32,ts,ts79 H amN1,am23,am80,am90,ts4 X X174174条件致死突变型的互补试验条件致死突变型的互补试验852 2）T4T4突变型的互补试验突变型的互补试验86T4T4突变型的互补试验突变型的互补试验872 2、顺反子、顺反子顺反子的概念（顺反子的概念（cistron）：）：不同的突变型之间没有互补的功能区，即一个功能水平上的基因，即结构基因，为决定一条多肽链合成的功能单位。反式排列、顺式

45、排列、顺反试验顺反试验：顺反试验：指将两个突变分别处于顺式和反式，根据其表型 确定两个突变是否是同一基因的试验。（看顺式 反式排列是否有功能上的互补）。方法方法:顺式 反式 结论 +/-+-/-+表现型 野生型 野生型 属于两个顺反子(基因)表现型 野生型 突变型 属于同一顺反子(基因)88顺反试验顺反试验如果两个突变发生在同一个基因内的两个不同位点上，在反式状态下只能产生突变的表现型，顺式状态下表现为野生型。若两个突变分别发生在两个相邻的基因内，在反式状态下表现为野生型，顺式状态下也表现为野生型。893 3、基因内互补（对顺反试验确定基因、基因内互补（对顺反试验确定基因的挑战）的挑战）机制：机制：90基因间互补基因内互补发生机率普遍存在只少数能发生缺失突变能不能酶活性同野生型明显低于野生型（仅25%）基因内互补与基因间互补的区别基因内互补与基因间互补的区别91二、利用分离基因研究二、利用分离基因研究病毒基因功能的方法病毒基因功能的方法1、用克隆序列进行互补试验2、转染后的瞬时表达92第六节第六节 哺乳动物病毒表达载体哺乳动物病毒表达载体一、瞬时表达载体二、稳定表达载体93本章内容回顾本章内容回顾n病毒变异的机制n病毒突变的定义、机制、类型、突变体n病毒重组的定义、机制、方式、意义n影响病毒表型的病毒间相互作用n病毒变异的实际意义