蛋白原核表达与纯化新生培训2课件.pptx

1、1234Escherichia coli最通用的原核表达系统最通用的原核表达系统u 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；u 基本不分泌，易形成包涵体(缺乏正确折叠的蛋白结构)，无蛋白加工等修饰；u 常见的原核表达载体：pET系列(T7 promoter，Novagen公司)；pQE系列(T5 promoter，Qiagen公司)；pGEX系列(GST融合表达，GE公司)；pBAD系列(Arabinose诱导型)目的基因扩增目的基因扩增目的基因插入表达载体目的基因插入表达载体重组基因转化入宿主菌中重组基因转化入宿主菌中外源基因的表达外源基因的表达外源基因在大肠杆菌

2、中表达流程外源基因在大肠杆菌中表达流程“基因基因载体载体菌株菌株培养培养”系统名称系统名称公司公司启动子启动子抗性抗性常用标签常用标签特点特点pGEXGEtacAmpGSTTag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GSTTagpMalNEBtacAmpMBPTag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBPTagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHisTag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHisTag同pET系统

3、u pET系统最初由Studier及其同事构建(Studier and Moffatt,1986)，是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统；u目的基因被克隆到pET质粒上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达有宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。uT7 RNA聚合酶机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。u T7lac启动子启动子:表达更加严谨表达更加严谨T7启动子启动子 常用于蛋白检测与纯化。常用于蛋白检测与纯化。有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置有时也可

4、增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。考虑因素考虑因素细胞特性细胞特性蛋白稳定性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型蛋白酶缺陷型B型菌株，型菌株，缺失缺失lon、ompT蛋白酶蛋白酶多种常用表达菌株均为此类，如多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等等启动子启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：聚合酶即可：BL21T7启动子需要能够提供启动子需要能够提供T7 RNA聚合酶的细胞：聚合酶的细胞：DE3溶源菌溶源菌抗性抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：细胞不能与载体带有相同的抗性：pET-28a+OrigamiB(DE3)No！pET-21b

5、+OrigamiB(DE3)Yes！严谨调控严谨调控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密码子稀有密码子Rosetta系列系列溶解性溶解性Origami系列：系列：Origami，Origami B和和Rosetta-gami稀有密码子：稀有密码子：不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA 无法正常在E.coli 里表达，是为“稀有”密码子。常用表达条件的优化常用表达条件的优化 培养基组分：葡萄糖会抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控，无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要 温度：影响表达速率、蛋白可溶性

6、与活性 IPTG：浓度影响表达速率、蛋白可溶性与活性其他因素：培养基体积与通气u 37摇床培养到OD600=0.4-0.1（建议OD600为0.6）约3-4小时可达到；u 从中取出一些样品作为未诱导对照，在剩下的样品中加入 IPTG至终浓度0.4（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），继续培养3-4小时；u 菌体5000g，4离心。如果需要，收集上清进行进一步分析；u 重悬细胞于1/10体积预冷的20 mM Tris-HCl或50 mM PBS（pH 8.0）中离心；u 除去上清，菌体保存于-70冰箱或继续纯化。常规的诱导条件常规的诱导条件实验目的实验目的表达策略表达策略活性分析活性分析

7、可溶表达可溶表达制备抗原制备抗原包涵体包涵体高纯度高纯度融合标签融合标签结构研究结构研究天然蛋白天然蛋白1.1.选择表达载体选择表达载体2.2.选择表达菌选择表达菌3.3.优化表达条件优化表达条件系统名称系统名称公司公司启动子启动子抗性抗性常用标签常用标签特点特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGSTTag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GSTTagpMalNEBtacAmpMBPTag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBPTagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHi

8、sTag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHisTag同pET系统菌株菌株适合启动子适合启动子特性特性BL21tac、trc(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7 RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)Transetta(DE3)T7/T7

9、lac(pET，pEASY)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxin reductase/glutathione reductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因毒基因：基因表达产物：基因表达产物即目的蛋白，影响宿主生长（即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性毒性”）BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用利用T7溶溶菌酶的严谨调控机制菌酶的严谨调控机制胞内表达胞内表达可溶可溶/包涵包涵体体不需要不

10、需要有有/无无有有最高最高50%50%蛋白种类多，需裂解菌体，蛋白种类多，需裂解菌体，复杂复杂周质表达周质表达多为可溶多为可溶需要需要有有有有较少较少4%4%蛋白种类少，需渗透压休蛋白种类少，需渗透压休克，相对容易克，相对容易胞外分泌胞外分泌完全可溶完全可溶需要需要有有有有变化较大变化较大纯化简单。但机理不详，纯化简单。但机理不详，成功先例少成功先例少表面展示表面展示融合膜蛋白融合膜蛋白/嵌合于膜上嵌合于膜上需要需要-有有-适用于疫苗开发、抗体制适用于疫苗开发、抗体制备，前景广阔。备，前景广阔。表达定位表达定位 表达产物定位表达产物定位 菌液菌液离心离心菌体菌体细胞总蛋白细胞总蛋白培养基组分培

11、养基组分菌体菌体悬菌，裂解，离心悬菌，裂解，离心胞质可溶组分胞质可溶组分沉淀沉淀8 M8 M尿素或者尿素或者6 M6 M盐盐酸胍溶解，离心酸胍溶解，离心胞质不溶组分胞质不溶组分沉淀沉淀悬菌，渗透压休克悬菌，渗透压休克细胞周质组分细胞周质组分沉淀沉淀上清上清全菌全菌未诱导未诱导1.表达菌株选择：（pET系统）常规表达菌株：BL21 表达毒性蛋白：BL21pLys适合表达真核基因：Rosseta（BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺少的6种稀有密码子）2.诱导表达pET系统采用T7启动子，诱导剂：IPTG 诱导要素：IPTG浓度、诱导温度、诱导时间设置阴性对照：未加IPTG诱导3.SDS-PAGE、WB

12、检测，确定目的蛋白 未诱导、诱导后的全菌、诱导后上清、诱导后沉淀 无表达或表达量低无表达或表达量低 蛋白不可溶蛋白不可溶 蛋白纯化障碍蛋白纯化障碍 载体载体-菌株搭配不当菌株搭配不当载体构建错误，氨基酸序列发生移码突变等等载体构建错误，氨基酸序列发生移码突变等等pGEXtacBL21pMaltacBL21pETT7/T7lacBL21(DE3)BL21(DE3)pLysS Rosetta(DE3)OrigamiB(DE3)稀有密码子稀有密码子(表达真核基因）表达真核基因）影响：影响：翻译终止翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低移码突变，氨基酸序列错误，表达量低 或无表达或无表达 应对：

13、修饰密码子应对：修饰密码子 在宿主中补充稀有密码子的在宿主中补充稀有密码子的tRNAtRNARosettaRosetta系列菌株（系列菌株（NovagenNovagen公司）公司）RosettaRosetta中补充了：中补充了：AUAAGGAGACUACCCGGA1-7:Rosetta(DE3)1-7:Rosetta(DE3)同时进行了密码子修饰同时进行了密码子修饰8:BL21(DE3)8:BL21(DE3)9:9:空对照空对照M 1 2 3 4 5 6 7 8 9M 1 2 3 4 5 6 7 8 9优化诱导条件，增加蛋白溶解性优化诱导条件，增加蛋白溶解性 在 E.coli中表达的重组蛋白经

14、常以不溶的、无活性蛋白聚集体的形式表达，被称作包涵体。即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET 系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。诱导和培养条件诱导和培养条件：37（包涵体），30，低温(15-20)诱导过夜，IPTG浓度，诱导后的培养条件；促进正确折叠促进正确折叠：融合催化二硫键形成酶的标签(DsbA)，选择促二硫键形成的质粒和细胞（Origami系列菌株）细胞周质定位细胞周质定位：选择带有信号肽的载体（pET12/20/

15、22）融合表达融合表达：融合溶解性高的标签（Trx，GST，MBP）宿主菌宿主菌：尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株 裂解缓冲液裂解缓冲液：普通的Binding buffer中一些疏水或膜结构蛋白会是不溶的，但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。u定位：可溶蛋白定位在胞质、细胞周质或者胞外（培养基）包涵体主要定位在胞质和细胞周质；u特点：可溶蛋白具有正确折叠的天然构象且具备生物活性；包涵体：高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解。123Lane 1：37Lane 2：30Lane 3：2512pETpGEX蛋白纯化方法蛋白纯化方法-亲

16、和层析-凝胶过滤-离子交换层析亲和层析亲和层析：通过生物分子之间特异性的相互作用来分离物质的方法。特异性：配体配体受体受体 抗原抗原抗体抗体 底物底物酶酶 可逆性：改变条件可以使结合解除改变条件可以使结合解除金属螯合层析金属螯合层析66HisHisTagTag纯化纯化基本原理与特点基本原理与特点常用纯化流程常用纯化流程 常见问题与技巧常见问题与技巧基本原理与特点基本原理与特点利用固相化的金属离子介质（如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+）进行的亲和层析技术，欲分离的蛋白质与金属离子形成共配位复合物而结合，再通过降低pH、加入竞争物(如咪唑）洗脱，从而对蛋白质加以分离。Ni-Bea

17、ds 基质：琼脂糖凝胶 侧链：NTA、IDA 配基：Ni2+标签标签纯化用的填料或配基纯化用的填料或配基洗脱方法洗脱方法多聚组氨酸（6*His）螯合镍、铜、钴离子的填料 咪唑或降低 pH谷胱甘肽硫转酶（GST）键合谷胱甘肽的亲和填料 10-20mM 还原谷胱甘肽 多聚精氨酸（Poly-Arg）SP琼脂糖凝胶高盐 多聚半胱氨酸（Poly-Cys）活化巯基琼脂糖凝胶DTT多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）苯基琼脂糖凝胶乙二醇 Ni2+与组氨酸形成配位键与组氨酸形成配位键Ni-NTANi-IDA金属螯合层析法（金属螯合层析法（MMetal etal chelatechelate chromatogra

18、phy chromatography）Ni固相载体His HisHisProteinimidazoleelution价格低廉，适用范围广 样品处理样品处理 装柱，平衡装柱，平衡 上样上样 洗涤与洗脱洗涤与洗脱 柱子回收柱子回收 M 1 2 3 4 5 6M：Protein marker1：空载体对照2：包涵体3：纯化前可溶性总蛋白4：上柱结合后样品5：50 mM咪唑洗脱样品6：400 mM咪唑洗脱样品蛋白纯化例子：蛋白纯化例子：蛋白不结合蛋白不结合无标签无标签构建有误、提前终止（C端）、二级翻译起始（N端）测序，重新构建标签未暴露标签未暴露变性不充分，天然蛋白折叠，应充分变性结合条件不合适结合

19、条件不合适螯合剂、还原剂、咪唑、pH值 螯合剂EDTA0.1 mM（忌用）还原剂DTT1 mM（不推荐）-ME20 mM（慎用）咪唑 20 mM（因蛋白而异）洗脱条件不合适洗脱条件不合适咪唑浓度、pH值，应梯度洗脱非特异性结合非特异性结合 上调初始咪唑浓度 -ME 非离子型去垢剂、甘油、NaCl蛋白不完整蛋白不完整蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（C端）低温，蛋白酶抑制剂 重新构建填料过多填料过多蛋白杂带多蛋白杂带多M 1 2 3 4 5 6 7 8 9M：Protein marker1：样品裂解液2-9：等体积梯度洗脱蛋白纯化例子：蛋白纯化例子：洗脱条件不合适洗脱条件不合适咪唑浓度、

20、pH值 增加洗脱强度 蛋白结合能力强蛋白结合能力强 上调初始咪唑浓度蛋白浓度低蛋白浓度低 Western Blot 优化表达 蛋白未结合或被提前洗涤蛋白未结合或被提前洗涤 电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱蛋白洗脱无检出蛋白洗脱无检出M 1 2 3 4 5 6 7 8M：Protein marker1：空载体对照2：样品上柱前3：样品上柱后4：30 mM咪唑洗脱；5：100 mM咪唑洗脱6：150 mM咪唑洗脱；7：200 mM咪唑洗脱8：400 mM咪唑洗脱蛋白纯化例子：蛋白纯化例子：MMolecular Microbiology&olecular Microbiology&F Food Safety Laboratoryood Safety LaboratoryThanks for your attention!