基本实验技术完整课件.ppt

1、基本实验技术基本实验技术.一一 分子克隆分子克隆分子克隆分子克隆指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合-重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。.载体构建载体构建将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大肠杆菌，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而克隆基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。.慢病毒载体（慢病毒载体（Lentiviral vector,LVs）是在 HIV

2、-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或 RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒稳定细胞株构建慢病毒稳定细胞株构建.转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。可通过转染干扰片段或过表达质粒，研究基因的作用。siRNA转染在一周内有效，需要马上进行功能实验。但转染效率受细胞类型及细胞状态影响，对于难以转染的细胞，建议用慢病毒构建稳定细胞株再进行后续实验，比如神经元细胞、干细胞。.实时定量实时定量 PCR(Real-Time Quantitative Polymerase ChainReaction)是在经典 PCR技术基础上，通过在 PCR 反应体系中加入荧光基

3、团，利用特定仪器检测荧光信号积累的强弱，进而实时监测每一轮 PCR 反应产物，并对与其产物量呈正相关的初始模板进行定量分析的技术。二二 基因表达与调控基因表达与调控.绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究.染色质免疫共沉淀（染色质免疫共沉淀（Chromtin Immuno Precipitation，CHIP）是目前唯一研究体内 DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，

4、并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。u 研究DNA 甲基化 u 检测已知蛋白的靶基因 u 组蛋白修饰 u 染色质结构 u 转录因子的协同结合.CHIP实验技术流程图.蛋白免疫印迹蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。三三 蛋白表达与功能分析蛋白表达与功能分析.四四 病理实验病理

5、实验免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），进行定位及相对定量研究的一种技术。能将目地抗原的表位及表达量直观的呈现出来。免疫荧光(Immunofluorescence，IF)是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。可以采用不同激发波长的荧光二抗标记不同的目的蛋白，同时观察两种蛋白的表达及共定位情况。.TUNEL细胞在发生凋亡时

6、，会激活一些 DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组 DNA断裂时，暴露的 3-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的 dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。是分子生物学与细胞形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡的形态特征。原位杂交（原位杂交（ISH）基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。可确定组织中

7、目的核酸的表达位置和表达量。.IHCIFTUNEL.五五 细胞功能实验细胞功能实验细胞生长曲线细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。可用于研究与细胞增殖相关基因及细胞毒性实验等。细胞增殖检测细胞增殖检测MTS原理为淡黄色的物质被细胞生物还原为一种可溶性的有色产物，利用分光光度计检测490nm处吸光值来反应细胞的增殖与细胞活性。颜色越深，OD值越大，细胞相对数量越多，细胞相对活力越高。区别：区别：MTS检测相对细胞数量与相对细胞活力（OD值与细胞数量间为对数关系且与细胞活力共同影响OD值）。生长曲线检测绝对细胞数量，及死活，但

8、对细胞活性如何无法得知。.细胞生长曲线细胞生长曲线MTS.细胞迁移能力检测细胞迁移能力检测细胞划痕愈合实验细胞划痕愈合实验是测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力。Transwell 迁移实验迁移实验在 Transwell 小室上室种细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。划痕愈合

9、实验比较细胞的侧向运动能力，Transwell迁移实验比较细胞纵向运动及变形能力。.Transwell小室小室.细胞划痕愈合细胞划痕愈合Transwell迁移迁移.细胞侵袭能力检测细胞侵袭能力检测Transwell 侵袭实验，侵袭实验，与Transwell迁移实验不同的是，侵袭实验上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。主要模拟细胞分泌金属蛋白酶消化细胞外基质。侵袭实验比较细胞分泌基质金属蛋白酶，破坏细胞外基质并向其他组织转移的能力。Transwell侵袭侵袭.六六 流式细胞术流式细胞术流式细胞术流式细胞

10、术（flow cytometry,FCM）一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。流式检测细胞周期流式检测细胞周期PI，即碘化丙锭，可以与细胞内 DNA 和 RNA 结合，采用 RNA 抑制剂将RNA 消化后，通过流式细胞术检测到的与 DNA 结合的 PI 的荧光强度直接反映了细胞内 DNA 含量的多少。由于细胞周期各时相的 DNA 含量不同，通常正常细胞 G1/G0 期具有二倍体细胞的 DNA 含量(2N)，而 G2/M 期具有四倍体细胞的 DNA 含量(4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细

11、胞术PI染色法对细胞内 DNA含量进行检测时，可以了解不同细胞周期各细胞亚群比例。由于晚期凋亡细胞 DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。.流式检测细胞凋亡流式检测细胞凋亡Annexin VPI双染法双染法，在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，Annexin V是一种分子量为 3536kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸检测凋亡早期细胞，PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，PI拒染活细胞和早期凋亡细胞，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将 Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。.流式检测细胞周期流式检测细胞周期流式检测细胞凋亡流式检测细胞凋亡.谢谢！谢谢！.