过氧化物酶同工酶的提取分离课件.ppt

1、过氧化物酶同工酶的提取、分离过氧化物酶同工酶的提取、分离实实 验验 四四学时：学时：9 91 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；2 2、掌握过氧化物酶掌握过氧化物酶(POD)(POD)活性测定的原理及方法。活性测定的原理及方法。3 3、了解过氧化物酶、了解过氧化物酶(POD)(POD)的生物学功能。的生物学功能。一、实验目的：一、实验目的：1 1、过氧化物酶：、过氧化物酶：过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程

2、中它的活性不断发光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶

3、在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。受到重视。二、实验原理二、实验原理:2 2、同工酶概念：、同工酶概念：同工酶同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如都有一定的关系，如PODPOD在细胞代谢过程中与在细胞代谢过程中与呼吸作用呼吸作用，光光合作用合作用，及，及生长素的氧化生长素的氧化等都有关系，等都有关系，测定测定PODPOD活性或其同活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢

4、变化工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。二、实验原理二、实验原理:(1)(1)定义：定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。相反的电极方向移动的现象。(2)(2)影响电泳效果的因素：影响电泳效果的因素：带电颗粒的大小和形状：带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；颗粒的电荷数：颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；溶液的粘度：溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；3 3、电泳：、电泳：溶液

5、的溶液的pHpH值：值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；反之越快；电场强度：电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；离子强度：离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；电渗现象：电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；支持物筛孔大小：支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。孔径小，电泳速度慢，反之则快。续续(2)(2)影响电泳效果的因素影响电泳效果的因素：聚丙烯酰胺凝胶

6、电泳是以聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶聚丙烯胺凝胶作作为载体的一种为载体的一种区带电泳区带电泳。4 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）聚丙烯胺凝胶聚丙烯胺凝胶由由丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体（AcrAcr）和和N N，N-N-甲甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺（BisBis）在催化剂作用下聚合而成。在具在催化剂作用下聚合而成。在具有有自由基自由基时，时，AcrAcr和和BisBis就会聚合。就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：引发产生自由基的方法有两种：化学法化学法 光聚合法光聚合法 (1)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶的生成：化学聚合：化学聚合：引发剂引发剂是过硫

7、酸铵是过硫酸铵(APAP)，催化剂催化剂N N、N N、NN、NN四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED），它的碱基催化），它的碱基催化APAP产生氧自由基，产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合化学聚合形成的凝胶孔形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备径较小，且重复性好，用来制备分离胶分离胶；光聚合：光聚合：催化剂催化剂是是核黄素核黄素（VBVB2 2），在痕量氧存在下，核黄素），在痕量氧存在下，核黄素光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，

8、且不稳定，适于发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的制备大孔径的浓缩胶浓缩胶。聚合反应：架桥物造成分枝端点自由基 可再延续freeradicalBisBis聚合反应交错连结自由基形成v聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；v链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；子筛的性质；v网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；凝胶具有抗对流的作

9、用；v长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；v该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。(2)(2)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：（1 1）凝胶度：）凝胶度：是指是指100mg100mg凝胶溶液中含有单体（凝胶溶液中含有单体（AcrAcr）和交联剂）和交联剂 （BisBis）的总克数，用）的总克数，用T%T%表示。表示。（2 2）交联度：）交联度：是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用百分数，用C%C%表示。表示。一般浓缩胶

10、的浓度为一般浓缩胶的浓度为7.5%7.5%，分离胶的浓度为，分离胶的浓度为10%10%。(3)(3)凝胶的质量决定因素：凝胶的质量决定因素：聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和C(交联百分浓度)。（）100babC（）100mbaT 上式中：a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液体积（ml）。当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4时，有效孔径最小，C大于或小于4时，有效孔径均变大，C大于5时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6和3。a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b

11、的重量比应在30左右。常用29：1第一、三个不连续性：第一、三个不连续性：凝胶孔径的不连续；凝胶孔径的不连续；缓冲液离子组成及各层凝胶缓冲液离子组成及各层凝胶pHpH的不连续；的不连续；在电场中形成的电位梯度的不连续。在电场中形成的电位梯度的不连续。第二、不连续系统中的三种物理效应：第二、不连续系统中的三种物理效应：电荷效应：电荷效应：分子筛效应分子筛效应:浓缩效应浓缩效应:(4)(4)不连续不连续PAGEPAGE的原理：的原理：不连续PAGE电泳胶体系统的组成：1电泳系统pH胶体浓度缓冲液上层(负极)缓冲液 2样本溶液 3浓缩胶 6.7 4分离胶 胶体 5下层(正极)缓冲液 Tris-HCl

12、Tris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.9 8.3 5%7%-在浓缩胶中的三个主要作用角色：甘氨酸:pH=8.9 负电荷 pI=6.7 不带电荷Cl-1:蛋白质蛋白质(酶酶):小分子大分子 浓缩效应：浓缩效应：分离胶浓缩胶样本8.96.7离子缺乏空间ABC+8.0v以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，在此酶存在下，H H2 2O O2 2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的的4-4-邻甲氧基苯酚，其反应为：邻甲氧基苯酚，其反应

13、为：v该红棕色的物质可用分光光度计在该红棕色的物质可用分光光度计在470nm470nm处测定其消光值，处测定其消光值，即可求出该酶的活性。即可求出该酶的活性。5、过氧化物酶活性测定过氧化物酶活性测定三、实验材料、主要仪器和试剂三、实验材料、主要仪器和试剂v1 材料：小麦幼苗材料：小麦幼苗v 2 仪器：仪器：（1）分光光度计；）分光光度计；（2）移液管）移液管（3）离心机（）离心机（4 000r/min）；）；（4）研钵）研钵 (5)(5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；(6)(6)稳流稳压电泳仪；稳流稳压电

14、泳仪；（7 7）高速冷冻离心机；）高速冷冻离心机；（8 8）电子天平；）电子天平；（9 9）电冰箱；）电冰箱；（1010）瓷盘、微量进样器；）瓷盘、微量进样器；（1111）电热恒温水浴锅；）电热恒温水浴锅；（1212）S-22pCS-22pC可见分光光度计；（可见分光光度计；（1313）电炉等）电炉等 3、试剂：、试剂：（1 1）1N HCl1N HCl：用：用12N12N的浓盐酸来配制；的浓盐酸来配制；（2 2）分离胶缓冲液（）分离胶缓冲液（pH8.9pH8.9的的Tris-HClTris-HCl缓冲液）：缓冲液）：（3 3）浓缩胶缓冲液（）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HClpH6.

15、7 Tris-HCl缓冲液）：缓冲液）：（4 4）分离胶丙胶贮液（）分离胶丙胶贮液（Acr-BisAcr-Bis贮液贮液）：）：（5 5）浓缩胶丙胶贮液（）浓缩胶丙胶贮液（Acr-BisAcr-Bis贮液贮液）：）：（6 6）过硫酸铵溶液（）过硫酸铵溶液（NH4NH4）2S2O82S2O8简写简写ApAp：（当天配制）；：（当天配制）；（7 7）核黄素溶液：）核黄素溶液：8%8%（8 8）电极缓冲液：（）电极缓冲液：（pH8.3Tris-pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）甘氨酸缓冲液）（9 9）40%40%蔗糖：蔗糖：（1010）pH4.7pH4.7乙酸缓冲液乙酸缓冲液：（1111）样品提取液

16、：）样品提取液：（1212）0.5%0.5%的溴酚蓝：的溴酚蓝：0.5g0.5g溶于溶于100ml100ml无离子水；无离子水；（1313）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：1g1g联苯胺加联苯胺加9ml9ml冰醋酸，溶解后加冰醋酸，溶解后加36ml36ml水用时加水用时加160ml160ml水水加加Vc140.8mgVc140.8mg加几滴加几滴30%30%过氧化氢原液。联苯胺是致癌物质，过氧化氢原液。联苯胺是致癌物质，称取时应戴手套；称取时应戴手套；（1414）0.05M pH5.50.05M pH5.5磷酸缓冲溶液；磷酸缓冲溶液；（1515）0.05M 0.0

17、5M 愈创木酚；愈创木酚；（1616）2%H2%H2 2O O2 2 ；1 1、贮液的配制：贮液的配制：2 2、凝胶的制备：凝胶的制备：2.12.1 胶板的制备：胶板的制备：2.22.2 分离胶的制备：分离胶的制备：2.32.3 浓缩胶的制备：浓缩胶的制备：3 3、酶液的制备：、酶液的制备：4 4、装槽、点样：、装槽、点样：5 5、电泳：、电泳：6 6、剥胶、固定、染色：、剥胶、固定、染色：四、实验步骤：四、实验步骤：2.1 2.1 胶板的制备：胶板的制备：2.2 2.2 分离胶的制备：分离胶的制备：按下表制备分离胶按下表制备分离胶试剂名称试剂名称分离胶缓分离胶缓冲液冲液分离胶丙分离胶丙胶贮液

18、胶贮液ApAp无离子水无离子水体积比体积比1 12 24 41 1取用量取用量（mlml）3 36 612123 3 胶灌至距梳子齿下端胶灌至距梳子齿下端1cm1cm 灌毕灌毕封上一层水加速聚封上一层水加速聚合合当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。2.3 2.3 浓缩胶的制备：浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶按下表制备浓缩胶 试剂名称试剂名称 浓缩胶缓浓缩胶缓冲液冲液浓缩胶丙胶浓缩胶丙胶贮液贮液ApAp蔗糖蔗糖体积比体积比1 12 22 22 2取用量取用量1 12 22 22 2 用滤纸吸干水用滤纸吸干水倒入浓缩胶倒入浓缩胶插入梳子插入梳子封水，封水，照光照光当

19、胶色由黄变为乳白色表明聚合好。当胶色由黄变为乳白色表明聚合好。3 3、酶液的制备：、酶液的制备：称取大麦幼苗茎部称取大麦幼苗茎部1g 1g 加样品提取液加样品提取液1ml 1ml 于冰浴中研成匀浆于冰浴中研成匀浆然后以然后以2ml2ml提取液分几次洗入提取液分几次洗入离心管离心管在高速离心机上以在高速离心机上以40004000转转/每分钟，离心每分钟，离心10min 10min 倒出上清液，以等量倒出上清液，以等量40%40%蔗糖混合蔗糖混合低温低温放置待用。放置待用。4.1 4.1 装槽：装槽：取出胶板下端胶条取出胶板下端胶条用滤纸擦净凡士用滤纸擦净凡士林油林油将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧

20、将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）向内）上下槽装电极缓冲液。上下槽装电极缓冲液。4.2 4.2 点样：点样：轻拔电泳梳子轻拔电泳梳子用微量进样器点样用微量进样器点样每孔约每孔约30l30l。5 5、电泳：、电泳：接通电源接通电源稳流稳流调节电流到每孔调节电流到每孔1mA1mA左右左右当溴酚蓝前沿进入分离胶后，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流可适当加大电流待前沿下行到距胶末待前沿下行到距胶末1cm1cm处，停止电泳。处，停止电泳。6 6、剥胶、固定、染色：、剥胶、固定、染色：将凝胶板取下将凝胶板取下放入装水瓷盘中放入装水瓷盘中剥剥下胶片下胶片并浸洗二次并浸洗二次倒去水倒去水加入固定加入固定液液1010分钟分钟倒去固定液倒去固定液加显色液（联苯加显色液（联苯胺），显色胺），显色观察记录。观察记录。绘制酶谱，计算出迁移率；绘制酶谱，计算出迁移率；五、结果与计算：五、结果与计算：六、思考题：六、思考题：1 1、影响电泳的主要因素有哪些？、影响电泳的主要因素有哪些？2 2、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个 不连续，及三种物理效应。不连续，及三种物理效应。