食品中微生物产物鉴定课件.ppt

1、第四十一讲第四十一讲 食品中微生物产物的鉴定食品中微生物产物的鉴定1、阻抗测定法（、阻抗测定法（impedance）阻抗：交流电路中导电物质对电流所起的阻碍和抵抗作用，可由电阻抗：交流电路中导电物质对电流所起的阻碍和抵抗作用，可由电导和电容计算。导和电容计算。原理：微生物可使培养基中电惰性底物，如碳水化合物、蛋白质等原理：微生物可使培养基中电惰性底物，如碳水化合物、蛋白质等营养物质代谢成为电活性产物（酸、碱等），当微生物生长繁殖时营养物质代谢成为电活性产物（酸、碱等），当微生物生长繁殖时，培养基中的电惰性分子即为许多电活性分子所取代，从而使培养，培养基中的电惰性分子即为许多电活性分子所取代，从

2、而使培养基的电导性增大，培养基的阻抗降低。通过绘制培养基电阻抗随时基的电导性增大，培养基的阻抗降低。通过绘制培养基电阻抗随时间变化的阻抗曲线图，进行微生物鉴定及微生物数量判断。间变化的阻抗曲线图，进行微生物鉴定及微生物数量判断。一、一、物理方法物理方法2、微量量热法、微量量热法 （Microcalorimetry）微量量热法是基于自动、连续检测热效应变化过程而建立的热微量量热法是基于自动、连续检测热效应变化过程而建立的热化学方法。化学方法。原理：是利用量热计测定微生物生长时的微小温度变化来计算原理：是利用量热计测定微生物生长时的微小温度变化来计算微生物的数量，并对微生物进行鉴定。微生物的数量，

3、并对微生物进行鉴定。特点：特点：灵敏、快速灵敏、快速二、化学方法二、化学方法微生物在生长过程中能够表现出一些特定的现象，产生一些特定的微生物在生长过程中能够表现出一些特定的现象，产生一些特定的物质，通过对它们的分析物质，通过对它们的分析 可以实现对微生物的快速检测与分析可以实现对微生物的快速检测与分析1、测定热稳定性、测定热稳定性核酸酶（核酸酶（DNAse）原理：原理：金黄色金黄色葡萄球菌能产生葡萄球菌能产生特有的热稳定性核酸酶以及特有的热稳定性核酸酶以及凝固酶，凝固酶，通过测定食物中的热稳定性核酸酶可以检测食物金黄色葡萄球菌的通过测定食物中的热稳定性核酸酶可以检测食物金黄色葡萄球菌的数量。数

4、量。热稳定性热稳定性核酸酶是核酸酶是S.aureus生长的标志；生长的标志；凝固酵素是产肠毒素菌株的标志凝固酵素是产肠毒素菌株的标志研究表明：有研究表明：有0.34单位的热稳定性核酸酶存在时，表明有某种金黄单位的热稳定性核酸酶存在时，表明有某种金黄色葡萄球菌生长，而此时相当于金黄色葡萄球菌产生色葡萄球菌生长，而此时相当于金黄色葡萄球菌产生9.5103ug肠毒素。热稳定性核酸酶检测法可以作为指示金黄色葡萄球菌生长肠毒素。热稳定性核酸酶检测法可以作为指示金黄色葡萄球菌生长的方法。的方法。2、ATP的测定的测定ATP测定计数法的测定计数法的原理：原理：每个细菌细胞中的ATP含量恒定，含量为10-18

5、-10-17 mol，ATP在细胞死亡2h后消失。通过测定样品中ATP的量就可以计算出微生物细胞数量。工作工作原理：原理：ATP能与荧光素酶发生反应，产生特异性荧光，荧光强度与ATP含量成正比，所以通过分析荧光强度，计算样品中微生物的ATP量，就可以推算出总活菌数。105cfu的细菌含有4 104mol/L ATP。在106109cfu/g范围内，微生物的ATP含量和细菌数呈线性关系。vATP法已经用于鸡肉、猪肉和牛肉的检测。3、辐射测量法（、辐射测量法（Radiometric）原理：原理：微生物在代谢过程中可以产生CO2，如果14C标记培养基中的碳源，如若碳源，如若微生物利用，则会释放14C

6、O2，只需用放射能计数器检测14CO2含量的有无及增加情况，便可确定样品中微生物的存在及生长情况。不同微生物对各种物质利用能力不同，放射性标记的物质也不同。常用的标注物是14C-葡萄糖，对于一些特殊的微生物也可使用14C-甲酸盐或14C-谷氨酸盐。优点：速度快：优点：速度快：通常只需618h。使用范围：使用范围：主要用于医用微生物的检测。例如，医用上常采用13C尿素呼气质谱仪诊断体内幽门螺旋杆的感染情况。亦可用于食品和水中微生物的检测。三、食品微生物的指纹识别和鉴定三、食品微生物的指纹识别和鉴定“指纹指纹”概念：由于每种微生物的化学组分（概念：由于每种微生物的化学组分（DNA、蛋白质）、蛋白质

7、）结构、性能有差别及其特异性代谢产物等通过分析技术出结构、性能有差别及其特异性代谢产物等通过分析技术出现的特征性的图谱。现的特征性的图谱。1、血清学方法、血清学方法 血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。血清学反应的特点：抗原抗体的结合具有特异性，当有共同抗原存在时，会出现交叉反应。因此，可利用特殊的抗体鉴定同源抗原特殊的抗体鉴定同源抗原 2、噬菌体（、噬菌体（phage）类型）类型原理：原理：根据噬菌体和它的宿主细菌之间的特殊关系，用已知的根据噬菌体和它的宿主细菌之间的特

8、殊关系，用已知的噬菌体鉴定其特定的宿主细菌。噬菌体鉴定其特定的宿主细菌。3、分子生物学方法、分子生物学方法v 基因探针技术基因探针技术v DNA扩增法扩增法v 限制性片段长度多态性技术限制性片段长度多态性技术v 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳（1）基因探针技术）基因探针技术探针（探针（Probe）：经过）：经过标记标记的一段的一段短核苷酸短核苷酸，用，用于检测与之于检测与之同源同源的核苷酸序列。的核苷酸序列。可检测的细胞数量：可检测的细胞数量：10106 6-10107 7 必须进行细胞富集必须进行细胞富集！细胞数量为细胞数量为 10108 8，检测需要，检测需要10-12h（2）DNA扩增法扩

9、增法又称多聚酶链反应又称多聚酶链反应 Polymerase Chain Reaction，PCR 1985年，美国年，美国PE-Cetus 公司人类遗传公司人类遗传学研究室的学研究室的Kary Mullis 发明发明 1993年，年，Mullis 获得诺贝尔获得诺贝尔化学奖化学奖PCR的基本原理的基本原理PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于 DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性低温退火引物 延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片

10、段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析 微生物群体结构。Step 1Step 1：双链双链DNADNA热变热变性（性（9494）；）；Step 2Step 2：引物与模板引物与模板单链单链DNADNA退火（退火（5555）；）；Step 3Step 3：DNADNA的聚合延的聚合延伸反应（伸反应（7272）；）；Step 4Step 4：扩增的双链扩增的双链DNADNA再次热变性（返回再次热变性（返回S

11、tep 1Step 1）。）。（3）脉冲场凝胶电泳技术）脉冲场凝胶电泳技术 是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。原理：对要分离的大分子量线性DNA分子采用交变脉冲电场琼脂糖凝胶电泳技术,脉冲电场方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,重新定向需要的时间越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时,DNA便分子量大小分开,经EB（溴化乙锭）染色后在凝胶上出现按分子大小排列的电泳带型。1、荧光荧光抗体法（抗体法（FA）1942年创立，在食品和医学微生物中应用广泛。

12、年创立，在食品和医学微生物中应用广泛。原理：抗体与荧光物质结合而带有荧光，与相应抗原结合后，在原理：抗体与荧光物质结合而带有荧光，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下可以观察，也可计数。荧光显微镜下可以观察，也可计数。荧光素：异硫氰酸荧光素（荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）若丹名若丹名B（Rhodamine B）四、免疫学方法四、免疫学方法2、沙门氏菌、沙门氏菌1-2实验（实验（1-2 Test）原理：抗原抗体结合形成肉眼可见的免疫带原理：抗原抗体结合形成肉眼可见的免疫带在一个特殊的含两个容器的塑料设备中进行：在一个特殊的含两个容器的塑料设备中进行：一个容器中装有一个容器中装有选择性液体选择性液

13、体培养基，另一个中装有培养基，另一个中装有非选择非选择性运动性性运动性培养基（半固体），并含有培养基（半固体），并含有鞭毛抗体鞭毛抗体。恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性培养后进入非选择恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性培养后进入非选择性培养基，并与其中的抗体结合形成免疫带。性培养基，并与其中的抗体结合形成免疫带。一种快速检测有动力的沙门氏菌的方法一种快速检测有动力的沙门氏菌的方法Inoculationchamber优点：将血清学反应和生化增菌过程结合起来，特异性强；优点：将血清学反应和生化增菌过程结合起来，特异性强；不需特殊实验室条件，简便不需特殊实验室条件，简便；8-14小时内得出结果，快

14、速小时内得出结果，快速。缺点：不能检测非运动型沙门氏菌，缺点：不能检测非运动型沙门氏菌，免疫条带的判断有主观因素。免疫条带的判断有主观因素。待将酶标记的抗原或抗体结合在固相载体上，滴加样品后，若待将酶标记的抗原或抗体结合在固相载体上，滴加样品后，若样品中含有酶反应的底物，则底物会被酶催化生成有色产物，样品中含有酶反应的底物，则底物会被酶催化生成有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关产物的量与样品中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。浅进行定性或定量分析。原理：原理：3、酶联免疫吸附剂测定酶联免疫吸附剂测定 ELISA可用于测定抗原或抗体。测定中

15、有三个必要的试剂：可用于测定抗原或抗体。测定中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂免疫吸附剂”（immunosorbent）；）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物结合物”conjugate）；）；（3）酶反应的底物（）酶反应的底物（substrate）。）。固相载体固相载体 固相载体作为吸附剂和容器，不参与化学反应。最常用的是固相载体作为吸附剂和容器，不参与化学反应。最常用的是聚聚苯乙烯苯乙烯，具较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上，具较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，

16、且价格低廉，故被普遍采用。后仍保留原来的免疫学活性，且价格低廉，故被普遍采用。4、鲎、鲎(后）后）试剂测定法试剂测定法 目前最灵敏的测定目前最灵敏的测定-菌细胞壁菌细胞壁中内毒素中内毒素的方法的方法原理：原理：内毒素与鲎溶解物之间发生生化反应，一小时后形成一种内毒素与鲎溶解物之间发生生化反应，一小时后形成一种胶状物。胶状物。革兰氏阴性菌可通过产生的内毒素进行鉴定，内毒素是由菌体外膜裸露的脂多糖革兰氏阴性菌可通过产生的内毒素进行鉴定，内毒素是由菌体外膜裸露的脂多糖和被外膜包围的类脂和被外膜包围的类脂A构成的。构成的。鲎变形细胞溶解物实验采用来自马蹄蟹血液的血细胞溶菌蛋白。溶菌蛋白是已知的鲎变形细

17、胞溶解物实验采用来自马蹄蟹血液的血细胞溶菌蛋白。溶菌蛋白是已知的对内毒素最敏感的物质。在少量的溶菌液中加入待测样品，并在对内毒素最敏感的物质。在少量的溶菌液中加入待测样品，并在37培养培养1h。内毒。内毒素的存在会导致胞溶物凝胶。素的存在会导致胞溶物凝胶。鲎试剂能检出鲎试剂能检出1.0pg脂多糖。由于大肠杆菌含有脂多糖。由于大肠杆菌含有3.0fg脂多糖，所以能检出脂多糖，所以能检出300个个革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌。鲎试剂法鲎试剂法鲎试剂法首次应用于食品检验是检测碎牛肉中的腐败菌。鲎试剂法首次应用于食品检验是检测碎牛肉中的腐败菌。内毒素的滴定度随着革兰氏阴性细菌数量的增加而增加。内毒素的滴定度随着革兰氏阴性细菌数量的增加而增加。由于冷藏鲜肉的变质通常是由革兰氏阴性菌引起的，所以鲎由于冷藏鲜肉的变质通常是由革兰氏阴性菌引起的，所以鲎试剂法是快速检测革兰氏阴性菌总菌数的好方法。试剂法是快速检测革兰氏阴性菌总菌数的好方法。这种方法适合于评价巴氏杀菌前后乳的大肠菌群卫生质量。这种方法适合于评价巴氏杀菌前后乳的大肠菌群卫生质量。