原位杂交组织化学课件.ppt
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- 关 键 词:
- 原位杂交 组织化学 课件
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1、原位杂交组织化学原位杂交组织化学 (in situ hybridization histochemistry)一、原位核酸分子杂交(一、原位核酸分子杂交(ISHH)技术的)技术的基本原理基本原理是应用已知碱基顺序并带有标记物的是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针核酸探针与组织、与组织、细胞中细胞中待测的核酸待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合以按碱基配对的原则进行特异性结合以形成形成杂交体杂交体,再应用与标记物相应的,再应用与标记物相应的检测系统检测系统,通过免,通过免疫组织化学方法在被检测的核酸疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成一定带颜色的原位形成一定带颜色的杂交信号。杂交信号。突
2、出优点:可以在原位精确测定含有靶核苷酸序列的突出优点:可以在原位精确测定含有靶核苷酸序列的细胞类型及分布细胞类型及分布,有形态学上的意义。有形态学上的意义。二、探针二、探针1 1、概念、概念探针探针(Probe):(Probe):是含有是含有互补顺序互补顺序的的外源性外源性被被标记标记的的DNADNA或或RNARNA片段片段。是在原位杂交中用于检测细胞内特定。是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNADNA或或RNARNA顺序顺序定位的特殊试剂。探针的碱基序列是已知的,只能与特定定位的特殊试剂。探针的碱基序列是已知的,只能与特定的核酸分子结合。的核酸分子结合。2 2、常用探针种类:、常用探针种类:
3、DNADNA探针探针:ssDNA、dsDNA)、)、cDNA探针探针RNARNA探针:探针:同义同义RNA探针、反义探针、反义RNA探针(探针(cRNA)。)。RNA探针是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应极高。探针是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应极高。寡核苷酸探针:寡核苷酸探针:DNA合成仪依杂交的靶核苷酸序列合成。合成仪依杂交的靶核苷酸序列合成。探针分子一般探针分子一般20-50bp。3 3、探针标记的种类:、探针标记的种类:放射性标记放射性标记-标记物为放射性同位素,如标记物为放射性同位素,如3 3H H、3535S S、3232P P。敏感性高,特异性强,但对人体有伤害。敏感性高,
4、特异性强,但对人体有伤害。非放射性标记非放射性标记-多采用生物素(内源性生物素的存在限多采用生物素(内源性生物素的存在限 了其应用)、了其应用)、地高辛(地高辛(DigDig)、荧光素、酶等标记)、荧光素、酶等标记。地高辛标记物地高辛标记物 洋地黄毒苷洋地黄毒苷(Dig),不会产生内,不会产生内源性相似物质的干扰,敏感性与源性相似物质的干扰,敏感性与放射性核素标记的探针相仿。杂放射性核素标记的探针相仿。杂交的切片背景好、细胞定位准确,交的切片背景好、细胞定位准确,是是当前杂交化学最为流行的方法。当前杂交化学最为流行的方法。三、原位杂交组织化学方法三、原位杂交组织化学方法1 1、原位杂交的类型:
5、、原位杂交的类型:根据探针标记物是否能被直接检测到,分为直接法根据探针标记物是否能被直接检测到,分为直接法和间接法。和间接法。直接法直接法:标记物为放射性同位素、酶或荧光。标记物为放射性同位素、酶或荧光。间接法间接法:标记物为半抗原,如生物素或地高辛。标记物为半抗原,如生物素或地高辛。2 2、原位杂交技术基本方法、原位杂交技术基本方法 杂交前准备:标本制备、探针制备杂交前准备:标本制备、探针制备 杂交:杂交:杂交后处理:杂交后处理:显示:显示:1 1、固定、固定 保持细胞形态结构;保持细胞形态结构;最大限度的保存细胞内的最大限度的保存细胞内的DNADNA或或RNARNA的水平;的水平;使探针易
6、于进入组织或细胞。使探针易于进入组织或细胞。对于对于DNADNA来说,固定剂的种类和浓度并不十分重要。来说,固定剂的种类和浓度并不十分重要。RNARNA非常容易降解非常容易降解,固定剂,固定剂 的种类、浓度、固定时间非常的种类、浓度、固定时间非常重要。而且取材后应尽快冷冻或固定。在解释重要。而且取材后应尽快冷冻或固定。在解释ISHHISHH的结果的结果是应考虑到取材至冷冻或进入固定剂这段时间对是应考虑到取材至冷冻或进入固定剂这段时间对RNARNA保存保存多带来的影响。多带来的影响。杂交前准备杂交前准备固定剂:固定剂:最常用多聚甲醛(不会与蛋白质产生广泛的最常用多聚甲醛(不会与蛋白质产生广泛的交
7、叉连接,不会影响探针穿透细胞或组织),被公认交叉连接,不会影响探针穿透细胞或组织),被公认为为ISHHISHH较为理想的固定剂。较为理想的固定剂。对于对于mRNAmRNA的定位,的定位,常采用的方法是:常采用的方法是:组织也可在取材后直接组织也可在取材后直接置于液氮冷冻,切片后置于液氮冷冻,切片后将其浸入将其浸入4%多聚甲醛多聚甲醛约约10分钟,空气干燥后分钟,空气干燥后保存在保存在-70,可保存数可保存数月之久。月之久。将组织固定于将组织固定于4%的多聚甲的多聚甲醛磷酸缓冲液中醛磷酸缓冲液中1-2h,在,在冷冻前浸入冷冻前浸入15%蔗糖溶液蔗糖溶液中,置中,置4冰箱过夜,次日冰箱过夜,次日切
8、片或保存在液氮中。切片或保存在液氮中。2 2、玻片处理、玻片处理 包括载玻片和盖片包括载玻片和盖片热肥皂水热肥皂水刷洗,刷洗,自来水自来水清洗干净后,置于清洗干净后,置于清洁液清洁液中浸中浸泡泡2424小时,小时,清水清水洗净烘干,洗净烘干,95%95%酒精中浸泡酒精中浸泡24h24h后蒸馏后蒸馏水冲洗,烘干。烘箱温度最好在水冲洗,烘干。烘箱温度最好在150150或以上过夜以去或以上过夜以去除任何除任何RNARNA酶。盖玻片最好硅化处理,锡箔纸包裹无尘酶。盖玻片最好硅化处理,锡箔纸包裹无尘保存。保存。粘片剂:粘片剂:多聚赖氨酸液、多聚赖氨酸液、APESAPES。最后用。最后用DEPCDEPC处
9、理的蒸处理的蒸馏水清洗玻片馏水清洗玻片1-21-2次。次。3 3、增强组织通透性、增强组织通透性 稀释的酸洗涤,去垢剂,清洗剂稀释的酸洗涤,去垢剂,清洗剂TritonX-100TritonX-100,某些消,某些消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶等)化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶等)注意:注意:在增强组织通透性的同时,也会降低在增强组织通透性的同时,也会降低RNARNA的保存的保存量和影响组织结构的形态。因此用量和孵育时间上应量和影响组织结构的形态。因此用量和孵育时间上应谨慎掌握。此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种谨慎掌握。此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度
10、而定。类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。4 4、防止、防止RNARNA酶的污染酶的污染在整个操作过程中应戴手套和口罩;在整个操作过程中应戴手套和口罩;玻璃器皿常规洗净后,应用玻璃器皿常规洗净后,应用RNARNA酶抑制剂(酶抑制剂(0.1%0.1%的二的二乙基焦磷酸盐液,乙基焦磷酸盐液,DEPCDEPC)浸泡处理()浸泡处理(37,2h37,2h),再用再用双蒸灭菌水漂洗几次,高压消毒去除双蒸灭菌水漂洗几次,高压消毒去除DEPC,DEPC,然后于然后于180 180 烘烤烘烤4h.;4h.;镊子高温烘烤。镊子高温烘烤。塑料器皿最好用一次性用品,使用前进行高压消毒;塑料器皿最好用一次性用品,使用
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