补体和细胞因子的检测课件.ppt

1、一、补体概述一、补体概述二、二、单个补体成分的测定单个补体成分的测定三、三、补体总活性测定补体总活性测定四、四、补体结合试验补体结合试验五、补体测定的应用五、补体测定的应用 n补体的固有成分补体的固有成分n经典途径经典途径:C1q:C1q、C1rC1r、C1sC1s、C4C4、C2C2；nMBLMBL途径：途径：MBL MBL、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、C4,C2;C4,C2;n旁路途径旁路途径:B:B因子、因子、D D因子；因子；n三条途径的共同末端通路三条途径的共同末端通路:C3:C3、C5-C9C5-C9。n调节蛋白调节蛋白：n备解素（备解素（P P因子）、因子）、C1C1抑制物、抑制

2、物、I I因子、因子、H H因子、因子、C4C4结合蛋白等；促衰变因结合蛋白等；促衰变因子（子（DAFDAF）、膜辅助蛋）、膜辅助蛋 白（白（MCPMCP）、同种限制因子（）、同种限制因子（HRFHRF）。）。n补体受体补体受体：nCR1-CR5CR1-CR5、C3aRC3aR、C2aRC2aR、C4aRC4aR等。等。由由肝肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生 均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属均为多糖蛋白，大多数电泳迁移率属、球蛋白球蛋白 含量约占血清球蛋白总量的含量约占血清球蛋白总量的10%，其中，其中C3含量最高、含量最高、D因子

3、因子含量最低含量最低 固有成份间的分子量差异较大，其中固有成份间的分子量差异较大，其中C1q最大、最大、D因子最小。因子最小。对热对热不稳定不稳定，56C、30min即被灭活，即被灭活，010 C条件下活条件下活性只能保持性只能保持34d。通常保存要。通常保存要-20 C。种属间含量有差异。种属间含量有差异。豚鼠豚鼠含量较高。含量较高。多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂等均可破坏补体等均可破坏补体 常作为单个补体成分的检测指标：常作为单个补体成分的检测指标：C3C3、C4C4、C1qC1q、B B因子和因子和C1C1酯酶抑制

4、物酯酶抑制物等等 测定方法：测定方法：免疫溶血法免疫溶血法 （检测单个补体成分的活性）（检测单个补体成分的活性）免疫化学法免疫化学法 （检测单个补体成分的含量）（检测单个补体成分的含量）补体受体：补体受体：存在于多种细胞存在于多种细胞 清除免疫复合物、净化机体内环境清除免疫复合物、净化机体内环境 检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力和计检测补体受体，有助于判断机体抗感染能力和计数相应的细胞数量数相应的细胞数量 目前已知的补体受体归为以下五类：目前已知的补体受体归为以下五类：CR1（CD35）CR2（CD21）CR3（CD11b/CD18）CR4(gp150/95，CD11c/18)C3aR/

5、C5aR 定义定义:是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征建立的单一补体成分检测法特征建立的单一补体成分检测法 指示系统指示系统:以以SRBCSRBC（sheep red blood cell,SRBCsheep red blood cell,SRBC）-抗抗SRBCSRBC为激活物和指示系统为激活物和指示系统 参照体系参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照照 结果判读结果判读:若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清若有溶血发生，表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分的

6、量呈正比，所缺乏的补体成分，且溶血程度与此补体成分的量呈正比，以以5050溶血溶血为终点为终点 （一）免疫溶血法（一）免疫溶血法 参照血清常称之参照血清常称之“R R（removeremove）”试剂试剂，即去除某种补体成，即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人分之意。已能筛选到的血清有人C2C2缺乏、豚鼠缺乏、豚鼠C4C4缺乏、小鼠缺乏、小鼠C5C5缺乏和家兔缺乏和家兔C6C6缺乏的血清缺乏的血清 免疫溶血法常用于免疫溶血法常用于C2C2、C3C3、C4C4、C5C5、C6C6等补体成分的检测。等补体成分的检测。其中以其中以C3C3、C4C4两成分的检测更为常见两成分的检测更为常见 检

7、测的是某补体活性而非含量检测的是某补体活性而非含量操作简便、快速、灵敏；不足之处在于红细胞和溶血素的操作简便、快速、灵敏；不足之处在于红细胞和溶血素的制备困难。制备困难。免疫化学法分类免疫化学法分类 1.1.单向免疫扩散平板法单向免疫扩散平板法 2.2.火箭免疫电泳火箭免疫电泳 3.3.散射比浊法散射比浊法 4.4.纳米金聚集复合物放大计时电位法纳米金聚集复合物放大计时电位法 5.5.基于银增强金标记物的阳极溶出伏安免疫分析法基于银增强金标记物的阳极溶出伏安免疫分析法 前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结前两种方法：手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差，已趋于淘汰果重复性

8、差，已趋于淘汰 后三种方法：通过仪器对补体的后三种方法：通过仪器对补体的C3C3、C4C4、B B因子等单个成因子等单个成分进行自动化测定分进行自动化测定 （二）免疫化学法（二）免疫化学法散射比浊法散射比浊法 原理原理 补体和相应抗体反应的补体和相应抗体反应的ICIC微粒引起液体浊度改变，激光微粒引起液体浊度改变，激光照射到照射到ICIC微粒上发生光线散射，散射光强度与微粒上发生光线散射，散射光强度与ICIC量正相关建量正相关建立的补体单个成分定量检测法。立的补体单个成分定量检测法。评价评价 反映所测补体成分的绝对量反映所测补体成分的绝对量 可进行标准化流程管理与质量控制可进行标准化流程管理与

9、质量控制 目前检测补体目前检测补体最常用最常用的方法的方法CH50CH50测定法测定法速率溶血法速率溶血法脂质体免疫检测法脂质体免疫检测法：操作简单快速，血清用量操作简单快速，血清用量少，准确度、精密度、特异性均较高，稳定性好，可自少，准确度、精密度、特异性均较高，稳定性好，可自动化分析动化分析 以以红细胞的溶解红细胞的溶解为指示，以为指示，以50%50%溶血为判断终点，称为溶血为判断终点，称为50%50%溶血实验溶血实验（50%complement 50%complement hemolysishemolysis）即即CH50CH50。应用绵羊红细胞应用绵羊红细胞（SRBCSRBC）和其相应

10、的抗体（和其相应的抗体（溶血素溶血素），作），作为能诱导补体活化经典途径的为能诱导补体活化经典途径的指示物指示物和和激活剂激活剂。补体能使溶。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞血素特异性结合的绵羊红细胞溶解，当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关。浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性相关。将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血将新鲜待检血清作不同稀释后，加入反应体系，测定溶血程度，以程度，以50%50%溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补溶血时的最小血清用量作为判定终点，可测知补体总溶血活性。体总溶血活性。（一）（一）CH50

11、测定法的原理测定法的原理溶血程度与补体含量的关系溶血程度与补体含量的关系 在适当、稳定的反应在适当、稳定的反应系统中，溶血反应与补系统中，溶血反应与补体的剂量依赖关系呈现体的剂量依赖关系呈现“S S”形曲线形曲线 在轻微溶血和接近完在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变全溶血时，补体量的变化对溶血程度的影响不化对溶血程度的影响不大，即溶血对补体量的大，即溶血对补体量的依赖不敏感。但在依赖不敏感。但在303070%70%溶血时，补体含溶血时，补体含量仅出现较小的变动，量仅出现较小的变动，溶血程度也会发生较大溶血程度也会发生较大的改变的改变 1.1.红细胞浓度的调整红细胞浓度的调整SRBC采自绵羊

12、颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏采自绵羊颈静脉，制备脱纤维羊血或用阿氏（Alsever）血液保存液制成抗凝血，）血液保存液制成抗凝血，4保存备用。使保存备用。使用前，调制成用前，调制成2%5%SRBC悬液。为使红细胞浓度标悬液。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，加入准化，可吸取少量红细胞悬液，加入2030倍的稀释液，倍的稀释液，在在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。（二）（二）CH50测定方法测定方法2.2.溶血素滴定溶血素滴定 溶血素可通过溶血素可通过SRBCSRBC免疫家兔获得，一般无需纯化免疫家兔获得，一般无需纯化 试验前需先行加热试验

13、前需先行加热56 30min56 30min或或60 3min60 3min以以灭活灭活补补体体 溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用溶血素有商品销售，可按标识效价稀释使用 自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补自行制备的溶血素需进行滴定，确定使用浓度，在补体活性测定中，大多使用体活性测定中，大多使用2 2个单位。个单位。溶血素效价稳定，一般使用溶血素效价稳定，一般使用3 3个月后再作重新滴定个月后再作重新滴定 3.3.稀释缓冲液稀释缓冲液 :磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液 4.50%4.50%溶血标准管溶血标准管 5.50%5.50%溶血总补体值的计算溶血总补体值

14、的计算 CH50 CH50 试验测定的是试验测定的是经典途径总补体溶血活性经典途径总补体溶血活性，所反映的是，所反映的是补体补体9 9种成分的综合水平。种成分的综合水平。方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积方法简便、快速，但敏感性低，补体的活性除与反应体积成反比外，还与反应所用的缓冲液、成反比外，还与反应所用的缓冲液、SRBCSRBC的数量以及反应温的数量以及反应温度有关度有关 总补体活性的参考范围为总补体活性的参考范围为5050100U/ml100U/ml CH50CH50增高增高见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等见于：急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等 CH50CH50降低降低

15、见于：统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性见于：统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎脊柱炎 、急性肾小球肾炎；补体大量丢失：外伤、手术和大、急性肾小球肾炎；补体大量丢失：外伤、手术和大失血；补体合成不足：肝硬化、慢性肝炎和重型肝炎。失血；补体合成不足：肝硬化、慢性肝炎和重型肝炎。（三）方法评价与临床意义（三）方法评价与临床意义补体结合试验补体结合试验(complement fixation test，CFT)将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。系统中抗原或抗体的传统方法。5种成分，种成分，3个系统个系统检测系统检测系

16、统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）补体系统补体系统：（补体的作用无特异性，既能与检测系统中：（补体的作用无特异性，既能与检测系统中的抗原抗体复合物结合，也能与致敏绵羊红细胞结合）的抗原抗体复合物结合，也能与致敏绵羊红细胞结合）指示系统指示系统：SRBC与相应溶血素。试验时常将其预先结与相应溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（合，成为致敏绵羊红细胞（sensitized sheep red blood cell，SRBCS）。）。反应系统与指示系统反应系统与指示系统争夺争夺补体系统，补体系统，先先加入反应系统给加入反应系统给其以优先结

17、合补体的机会。其以优先结合补体的机会。反应分两步进行反应分两步进行 第一步第一步:检测系统与补体的作用检测系统与补体的作用 第二步第二步:指示系统利用剩余补体的反应指示系统利用剩余补体的反应不溶血为补体结合试验不溶血为补体结合试验阳性阳性，而溶血为试验，而溶血为试验阴性阴性（一）试剂的准备（一）试剂的准备1.抗原或抗体抗原或抗体 用于试验的抗原或抗体用于试验的抗原或抗体:需要纯化需要纯化 纯度愈高，特异性愈强纯度愈高，特异性愈强 抗原与抗体比例适当抗原与抗体比例适当:确定抗原或抗体相应的使用单位确定抗原或抗体相应的使用单位 采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定采用方阵或棋盘法进行抗原与抗体滴定补

18、体结合试验方补体结合试验方法法由于该试验基于指示和由于该试验基于指示和试验两对抗原抗体系统试验两对抗原抗体系统竞争补体，因此，补体竞争补体，因此，补体必须恒量，且以满足指必须恒量，且以满足指示系统的溶血为度，示系统的溶血为度，过多会导致过多会导致假阴性假阴性，过少则引起过少则引起假阳性假阳性。2.2.补体补体 采用豚鼠血清为补体采用豚鼠血清为补体 对补体进行滴定和确定其对补体进行滴定和确定其用量，以能产生完全溶血的用量，以能产生完全溶血的最少补体用量为最少补体用量为1 1个实用单个实用单位位 正式试验时使用正式试验时使用2 2个实用个实用单位单位补体的性质不稳定，每次补体的性质不稳定，每次试验

19、前均应进行滴定试验前均应进行滴定 血清标本遇有抗补体现象时，血清标本遇有抗补体现象时，可作下列处理：可作下列处理：T加热灭活时提高加热灭活时提高12 12 T2020冻融后离心去沉淀冻融后离心去沉淀 T以以3mmol/L3mmol/L盐酸处理盐酸处理 T加入少量补体后再行灭活加入少量补体后再行灭活 T以白陶土处理以白陶土处理 T通入通入CO2 CO2 T以小白鼠肝粉处理以小白鼠肝粉处理 T用含用含1010新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释血清 3.待测标本待测标本 采血并及时分离血采血并及时分离血清用于检测或清用于检测或2020保存备用。保存备用。试验前，应先将血试验前，应先

20、将血清清5656加热加热30min30min以灭以灭活补体。活补体。（二）（二）正式试验正式试验 分类分类:小量法、微量法。以小量法、微量法。以小量法小量法常用常用(抗原、抗体、溶血抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加素、羊红细胞各加0.1ml0.1ml，补体，补体 0.2ml)0.2ml)。实验过程实验过程:稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、不同含稀释和处理后的标本与已知抗原或抗体、不同含量的补体温育量的补体温育与指示系统共育与指示系统共育 结果判度结果判度:对照管对照管:阴性对照管阴性对照管:溶血溶血 阳性对照管阳性对照管:不溶血不溶血 抗体或抗原对照管抗体或抗原对照管:完全溶血完全溶血 待

21、检血清对照管待检血清对照管:完全溶血完全溶血 绵羊红细胞对照管绵羊红细胞对照管:不出现自发性溶血不出现自发性溶血 补体对照管：补体对照管：受检血清受检血清 阳性阳性:不溶血不溶血 阴性阴性:溶血溶血 注意注意:若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不若上述各对照管不出现预期结果，则试验结果不可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。可靠，其可能原因应根据出错的对照管进行分析。2 2个单位个单位:全溶全溶1 1个单位个单位:全溶或略带少许红细胞全溶或略带少许红细胞 0.50.5个单位个单位:不发生溶血不发生溶血 优优 点点灵敏度高、所测定的抗体或抗原水平可达灵敏度高、所测定的抗体或抗原水平可

22、达0.05g/ml 0.05g/ml，出现交叉反应的机率较小，出现交叉反应的机率较小，可检测的抗原或抗体范围广泛，可检测的抗原或抗体范围广泛，无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高无需特殊设备、结果容易观察、试验条件要求不高 现现 状状影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，影响的因素多、各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等，现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被现代化、自动化抗原抗体检测方法的不断涌现，补体结合试验逐渐被遗弃遗弃补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型，其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着

23、启迪和指导作用免疫方法的建立有着启迪和指导作用 方法评价方法评价n图图1 1 抗原（抗原（AgAg）与抗体（与抗体（AbAb）结合形成免疫复合物（结合形成免疫复合物（ICIC）n图图2 2 免疫复合物与补体结合，使补体发生作用，失去活性免疫复合物与补体结合，使补体发生作用，失去活性。AgAgAgAg图图1图图2Ab补体（补体（complement）SRBCn图图1 1 绵羊红细胞与溶血素（绵羊红细胞与溶血素（hemolysinhemolysin）即抗绵羊红细胞结合，形成致即抗绵羊红细胞结合，形成致敏绵羊红细胞（敏绵羊红细胞（SRBCsSRBCs）。）。n图图2 2 致敏绵羊红细胞与补体结合，使

24、其激活，补体发生溶细胞作用，致敏绵羊红细胞与补体结合，使其激活，补体发生溶细胞作用，引起红细胞肿胀，发生溶血。引起红细胞肿胀，发生溶血。图图1图图2SRBCSRBC补体补体(complement)SRBCSRBChemolysinSRBCsSRBCs检测系统AgAgAb未知未知未知未知不存在不存在未生成未生成Ag已知已知指示系统指示系统SRBCSRBChemolysinSRBCs补体系统SRBCSRBCSRBCcomplementSRBCsAgAgcomplement补体系统AgAgSRBCSRBCSRBCs无无溶血现象溶血现象在反应的第一阶段，抗原与抗体结合在反应的第一阶段，抗原与抗体结合形

25、成抗原抗体复合物，抗原抗体复合形成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物与补体结合。物与补体结合。在反应的第二阶段，没有游离补体，在反应的第二阶段，没有游离补体，致敏绵羊红细胞不溶解，致敏绵羊红细胞不溶解，不发生溶血不发生溶血现象现象。在反应的第一阶段，抗原没有与抗体在反应的第一阶段，抗原没有与抗体结合，没有形成抗原抗体复合物，反结合，没有形成抗原抗体复合物，反应液中有游离补体存在。应液中有游离补体存在。在反应的第二阶段，补体与致敏绵羊在反应的第二阶段，补体与致敏绵羊红细胞结合，使其溶解，红细胞结合，使其溶解，发生溶血现发生溶血现象象。n反应不发生溶血，反应不发生溶血，证明待测物存在，证明待测物存在，

26、试验结果试验结果阳性阳性。n反应发生溶血，证反应发生溶血，证明待测物不存在，明待测物不存在，试验结果试验结果阴性阴性。n补体结合试验最早应用于梅毒的检测。补体结合试验最早应用于梅毒的检测。n补体结合试验曾广泛的应用于临床微生物学检验补体结合试验曾广泛的应用于临床微生物学检验中，比如：细菌、病毒、衣原体、立克次体等微中，比如：细菌、病毒、衣原体、立克次体等微生物所致疾病的血清学诊断。生物所致疾病的血清学诊断。n在对在对SARSSARS的诊断中，补体结合试验的灵敏度要高的诊断中，补体结合试验的灵敏度要高于直接做病毒的分离培养。于直接做病毒的分离培养。应用于补体含量和活性检测的试验应用于补体含量和活

27、性检测的试验 CH50 CH50试验，速率溶血法脂质体免疫检测法试验，速率溶血法脂质体免疫检测法:反映总反映总补体活性补体活性 免疫溶血试验免疫溶血试验 免疫化学试验免疫化学试验 免疫荧光技术免疫荧光技术检测补体单个成分及其检测补体单个成分及其裂解产物（裂解产物（C1qC1q、C3SP C3SP、C3C3、C4C4、B B因子等）和补体因子等）和补体受体受体补体检测方法小结补体检测方法小结n1 1、诊断病原体感染、诊断病原体感染 n2 2、检测补体的功能、检测补体的功能 n3 3、补体单个成分及其裂解产物的测定、补体单个成分及其裂解产物的测定 n4 4、相关疾病时补体的检测、相关疾病时补体的检

28、测 n（1 1）免疫性疾病）免疫性疾病 n（2 2）与补体有关的遗传性疾病）与补体有关的遗传性疾病 n（3 3）补体含量显著降低的疾病）补体含量显著降低的疾病 n（4 4）高补体血症）高补体血症 n5 5、补体参与的试验、补体参与的试验 n6 6、流行病学调查、流行病学调查 n7 7、补体应用于临床治疗后的检测、补体应用于临床治疗后的检测 补体含量和活性相关的疾病补体含量和活性相关的疾病1 1免疫相关性疾病：免疫相关性疾病：如自身免疫性疾病时，如自身免疫性疾病时，C1C1、C2C2、C3C3、C4C4和和HfHf等缺陷；等缺陷；超敏反应时（超敏反应时（IIIIII型超敏反应），型超敏反应），C

29、3aC3a、C5aC5a等过敏毒素的产生。等过敏毒素的产生。2 2与补体有关的遗传性疾病：与补体有关的遗传性疾病：C2C2、C3C3缺陷导致的严重感染；缺陷导致的严重感染；与与C1C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿 SLESLE患者出现的细胞表面患者出现的细胞表面CR1CR1缺陷与缺陷与C1CC1C清除障碍清除障碍 涉及涉及I I因子、因子、H H因子缺陷的肾小球肾炎；因子缺陷的肾小球肾炎；DAFDAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；C1qC1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及C1qC1q、C

30、1rC1r、C4C4、C2C2缺陷造成的免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。缺陷造成的免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。(图图)血管神经性水肿血管神经性水肿3补体含量显著降低的疾病补体含量显著降低的疾病：消耗增多消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多多.如如SLE.SLE.补体的大量丢失补体的大量丢失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者病患者补体合成不足补体合成不足:常见于肝脏疾病患者或营养不良的病常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。人。4高补体血症：高补体血症：偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。n1 1、掌握、掌握 CH50 CH50 试验的原理及方法学评价试验的原理及方法学评价 n2 2、掌握补体结合试验的原理及结果解释、掌握补体结合试验的原理及结果解释 n3 3、熟悉补体检测方法的分类、熟悉补体检测方法的分类要要 求求