第十章-DNA序列测定技术课件.ppt

1、DNADNA序列测定技术序列测定技术序列测定的技术和策略序列测定的技术和策略SangerSanger双脱氧链终止法测序双脱氧链终止法测序全自动激光荧光全自动激光荧光DNADNA测序测序第十章第十章 DNADNA序列测定技术序列测定技术DNADNA序列测定技术序列测定技术70年代末，年代末，Walter Gilbert发明化学法发明化学法 Frederick Sanger发明双脱氧终止法 手动测序，同位素标记80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）荧光代替同位素，计算机图象识别90年代中期，测序仪重大改进年代中期，测序仪重大改进 集束化

2、的毛细管电泳代替凝胶电泳2001年完成人类基因组框架图年完成人类基因组框架图 小鼠的基因组框架图也已完成，此外，果蝇、线虫、酵母和近五十种细菌类微生物及多种病毒的全序列分析也都已完成。DNADNA序列测定技术序列测定技术DNA测序技术进展年代一次测定的长度 每周可完成次数 碱基/（人周）1977504200198010020200019903006018000200055030001650000DNADNA序列测定技术序列测定技术第十三章第十三章 DNADNA序列测定技术序列测定技术第一节第一节 序列测定的技术和策略序列测定的技术和策略 目前应用的两种快速序列测定技术是目前应用的两种快速序列测

3、定技术是SangerSanger等（等（19771977）提出的酶法及提出的酶法及MaxamMaxam和和Gilbert(1977)Gilbert(1977)提出的化学降解提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。种或者多种残基上。双脱氧链终止法双脱氧链终止法 核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代核酸的序列分析，即核酸一级结

4、构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是测定技术是SangerSanger等（等（19771977年）提出的双脱氧链终止法年）提出的双脱氧链终止法及及MaxamMaxam和和GilbertGilbert（19771977年）提出的化学降解法，其中年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。DNADNA序列测定技术序列测定技术双脱氧链终止法双脱氧链终止法 原理示意图原理示意图DNADNA序列测定技术序列测定技术一、双脱氧链终止法一、双脱氧链终止法1

5、1、模板、模板 有两类有两类DNADNA可以用作酶法测序的模板可以用作酶法测序的模板纯单链纯单链DNADNA和经过热变性的和经过热变性的DNADNA碱变性的双链碱变性的双链DNADNA。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板其中有两个因素是至关重要的，这就是模板DNADNA的质的质量和所用量和所用DNADNA聚合酶的种类。聚合酶的种类。2 2、引物、引物 酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为合成寡核苷酸作为DNADNA合成的引物合成的引物将靶将靶DNADNA片段克隆于片段克隆于M13M13噬菌体或质粒载体的多克隆位噬菌体或质粒

6、载体的多克隆位点，再采用能与多克隆位点一侧的载体序列相退火的点，再采用能与多克隆位点一侧的载体序列相退火的通用引物进行序列测定。通用引物进行序列测定。DNADNA序列测定技术序列测定技术3 3、DNADNA聚合酶聚合酶 通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响酶，这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的通过链终止反应所获得的DNADNA序列的数量和质序列的数量和质量。量。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I KlenowI Klenow 片段片段 这种酶是最初用以建立这种酶是最初用以建立Sang

7、erSanger法的酶，也是法的酶，也是至今仍然广泛用于至今仍然广泛用于DNADNA序列测定的酶。序列测定的酶。缺陷：缺陷：KlenowKlenow片段的持续合成能力低，以致一些片段片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于并非由于dddd NTP NTP的掺入，而是因为聚合酶从模的掺入，而是因为聚合酶从模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。DNADNA序列测定技术序列测定技术这种酶对模板中的同聚核苷酸段或含其他牢固二级结这种酶对模板中的同聚核苷酸段或含其他牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。构的区域进行复制的效能很低。反转录酶反转录酶 尽管日

8、常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶解决一些由于模板用这个酶解决一些由于模板DNADNA中存在中存在A/TA/T或或G/CG/C同聚核同聚核苷酸区而引起的问题。苷酸区而引起的问题。测序酶测序酶 测序酶（测序酶（SequenaseTMSequenaseTM）是一种经过化学修饰的）是一种经过化学修饰的T7T7噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶。测序酶持续合成能力很强，聚合速聚合酶。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如率很高，对诸如dITPdITP和和7 7脱氮脱氮dGTPdGTP等用于提高分辨等用于提高分辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得

9、以分开的核苷率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的耐受性。它是测定长段酸类似物具有广泛的耐受性。它是测定长段DNADNA序列的序列的首选酶。首选酶。DNADNA序列测定技术序列测定技术TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶适用于测定在聚合酶适用于测定在37 37 形成大段稳定二形成大段稳定二级结构的单链级结构的单链DNADNA模板序列。这是因为模板序列。这是因为TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶在在70-7570-75活性最高，这一温度下即使是活性最高，这一温度下即使是GCGC丰富的模板丰富的模板也无法形成二级结构。也无法形

10、成二级结构。4 4、放射性标记、放射性标记dNTPdNTP3232PdNTPPdNTP 直至几年以前，实际上所有直至几年以前，实际上所有DNADNA测序反应都用测序反应都用3232PdNTPPdNTP来进行。然而来进行。然而3232P P发射的强发射的强粒子造成两个问粒子造成两个问题。题。a a、由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝、由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的胶上的DNADNA条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列的正确性并将制约从单一凝胶上能读出的核苷的序列的正确性并将制约从单一凝胶上能读出的核苷酸序列的长度。酸序列的长度。

11、DNADNA序列测定技术序列测定技术b b、3232P P的衰变会引起样品中的衰变会引起样品中DNADNA的辐射分解，因此用的辐射分解，因此用3232P P进进行标记的测序反应只能保存一两天，否则行标记的测序反应只能保存一两天，否则DNADNA将被严重将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。3535SdATPSdATP 由于由于3535S S衰变产生较弱的衰变产生较弱的粒子，其散射有所减弱，粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应中确切测定数百核苷酸的可以从一套反

12、应中确切测定数百核苷酸的DNADNA序列。此序列。此外，外，3535S S的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，测序反应可在测序反应可在2020保存至保存至1 1周，而分辨率不见下降。周，而分辨率不见下降。DNADNA序列测定技术序列测定技术DNA sequencingDNADNA序列测定技术序列测定技术二、化学二、化学DNADNA降解法降解法 与包括合成反应的链终止技术不同，与包括合成反应的链终止技术不同，MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert法要对原法要对原DNADNA进行化学降解。可以探测进行化学降解。可以探测DNADNA构象的

13、蛋白构象的蛋白质质DNADNA相互作用，是相互作用，是MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert法独具的鲜明特法独具的鲜明特点。点。一个末端标记的一个末端标记的DNADNA片段在片段在5 5组互相独立的的化学反组互相独立的的化学反应中分别被部分降解，其中每一组反应特异地针对某应中分别被部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一种或某一类碱基。因此生成5 5组放射性标记的分子，组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA

14、DNA分子，其分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNADNA全片段上的全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。DNADNA序列测定技术序列测定技术测序步骤：测序步骤：先用限制性内切酶把DNA切成100200bp 的测序材料；用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5末端上的磷酸；在5-OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；标记片段变性为单链；化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA，产生一组长度不等的DNA片段；经电泳

15、和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。DNADNA序列测定技术序列测定技术Maxam-Gilbert测序法的特异断裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecific Reaction to G 化學法无放射不能显相断裂处断裂处ATCGATCGATDNADNA序列测定技术序列测定技术 G反应：DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。

16、T+C反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。C反应：在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。DNADNA序列测定技术序列测定技术5PP 53HOOH 35HOOH 53HOOH 3532PP32 53HOOH 3532POH 3硫酸二甲酯甲酸肼肼NaClGG+AT+CC碱性磷酸碱性磷酸单酯酶单酯酶除去除去 5磷酸基磷酸基 多核苷酸多核苷酸磷酸激酶磷酸激酶-32P-ATP分离单链分离单链DNA分别在分别在4个个试管中进行试管中进行特异断裂特异断裂DNADNA序列测定技术序列测定技术GG+AT+CC5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GT

17、CATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G断裂产物断裂产物分别在分别在4个个泳道电泳泳道电泳从下到上依次读出从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列DNADNA序列测定技术序列测定技术 化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原序列来自原DNADNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此

18、，利用利用MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等以分析诸如甲基化等DNADNA修饰的情况，不可以通过化学保修饰的情况，不可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究护及修饰干扰实验来研究DNADNA二级结构及蛋白质与二级结构及蛋白质与DNADNA的的相互作用。然而，由于相互作用。然而，由于SangerSanger法既简便又快速，因此是法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。现今的最佳选择方案。三、测序策略三、测序策略开始测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的开始测序之前，必须根据待测序列区的长度，所

19、要求的测序精确度，以及现有的设施来制定测序总策略。测序精确度，以及现有的设施来制定测序总策略。DNADNA序列测定技术序列测定技术确证性测序确证性测序 确证性测序往往只需要仅仅一套反应，以取得双链确证性测序往往只需要仅仅一套反应，以取得双链DNADNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只须对其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于亚克隆于M13M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序。酶切片段进行测序。从头测序从头测序 从头测序的目的是要提供一段从头测序的目的是要提供一段DNADNA的准确核苷酸序列的准确核苷酸序列v 随机法

20、随机法 即先把待测即先把待测DNADNA的随机片段亚克隆入测序载体中分别的随机片段亚克隆入测序载体中分别进行测序，然后收集序列资料，最后排出待测进行测序，然后收集序列资料，最后排出待测DNADNA片段片段的全长序列。的全长序列。DNADNA序列测定技术序列测定技术v 定向法定向法 选择随机定向测定策略的影响因素选择随机定向测定策略的影响因素 a a、计算设备、计算设备 b b、靶、靶DNADNA的性质的性质 c c、完成测序计划所需时间、完成测序计划所需时间 d d、使用寡核苷酸合成仪的方便程度、使用寡核苷酸合成仪的方便程度 e e、序列的准确性、序列的准确性 f f、测序计划的下一步打算、测

21、序计划的下一步打算 DNADNA序列测定技术序列测定技术第二节第二节 SangerSanger双脱氧链终止法测序双脱氧链终止法测序一、测序反应一、测序反应单链单链DNADNA的制备的制备引物的准备引物的准备微量滴定板微量滴定板链延伸终止反应链延伸终止反应二、变性聚丙烯酰胺凝胶二、变性聚丙烯酰胺凝胶测序凝胶的主要参数测序凝胶的主要参数凝胶的长度凝胶的长度凝胶的宽度凝胶的宽度DNADNA序列测定技术序列测定技术凝胶的厚度凝胶的厚度凝胶的横截面形状凝胶的横截面形状加样槽加样槽 a a、在丙烯酰胺溶液聚合前将梳子插在溶液顶部形成、在丙烯酰胺溶液聚合前将梳子插在溶液顶部形成常规加样孔常规加样孔 b b、

22、在凝胶聚合以后插入鲨鱼齿梳子形成加样槽、在凝胶聚合以后插入鲨鱼齿梳子形成加样槽整块凝胶上的温度梯度整块凝胶上的温度梯度配制缓冲液梯度的聚丙烯酰胺凝胶配制缓冲液梯度的聚丙烯酰胺凝胶配制贮存液配制贮存液洗净玻璃板洗净玻璃板组装玻璃板组装玻璃板将梳子放在组装好的玻璃板的敞开端并检查是否贴切将梳子放在组装好的玻璃板的敞开端并检查是否贴切DNADNA序列测定技术序列测定技术在实验台上铺保护纸，戴上手套在实验台上铺保护纸，戴上手套将灌好胶的玻璃板放下将灌好胶的玻璃板放下立即将鲨鱼齿梳子的平整侧插入凝胶液约立即将鲨鱼齿梳子的平整侧插入凝胶液约0.5cm0.5cm。梳子。梳子两端插入液面的深度应当相同两端插入

23、液面的深度应当相同聚合聚合45min45min加样和电泳加样和电泳三、电泳后将凝胶干燥，放射自显影三、电泳后将凝胶干燥，放射自显影电泳结束后弃去电泳缓冲液，从电泳装置中取出玻璃电泳结束后弃去电泳缓冲液，从电泳装置中取出玻璃板板将玻璃板平放在保护纸上，使较小的玻璃板位于上方，将玻璃板平放在保护纸上，使较小的玻璃板位于上方，除去弹簧夹和所有胶带，慢慢将玻璃板撬开。除去弹簧夹和所有胶带，慢慢将玻璃板撬开。DNADNA序列测定技术序列测定技术分开两块玻璃后，可把加样次序在先的一侧的凝胶地分开两块玻璃后，可把加样次序在先的一侧的凝胶地角切去，以便在后续操作中能够认准凝胶的方向。角切去，以便在后续操作中能

24、够认准凝胶的方向。从固定液中取出玻璃板和凝胶。从固定液中取出玻璃板和凝胶。将玻璃板放在一张保护纸上。用手指小心抹平皱折或将玻璃板放在一张保护纸上。用手指小心抹平皱折或破损处。从玻璃上擦去剩余固定液但勿使纸巾与凝胶破损处。从玻璃上擦去剩余固定液但勿使纸巾与凝胶表面接触。表面接触。在凝胶上放一张在凝胶上放一张WhatmanWhatman 3MM 3MM滤纸，其长与宽均应比凝滤纸，其长与宽均应比凝胶大出胶大出2 23cm3cm。轻压滤纸使凝胶与滤纸的粗糙面紧贴。轻压滤纸使凝胶与滤纸的粗糙面紧贴。一手将滤纸扶住，另一手将玻璃板提起，迅速将玻璃一手将滤纸扶住，另一手将玻璃板提起，迅速将玻璃板反转，放在一

25、张干的保护纸上。板反转，放在一张干的保护纸上。将保护纸移至实验台边缘，一边拿住将保护纸移至实验台边缘，一边拿住3MM3MM滤纸的前边缘滤纸的前边缘向下接，加一边将玻璃板慢慢向实验桌的边缘移动。向下接，加一边将玻璃板慢慢向实验桌的边缘移动。3MM3MM滤纸从玻璃板上剥落时，凝胶应与滤纸相贴。滤纸从玻璃板上剥落时，凝胶应与滤纸相贴。DNADNA序列测定技术序列测定技术将将3MM3MM滤纸（凝胶朝上）放在另两张同样大小的滤纸（凝胶朝上）放在另两张同样大小的3MM3MM滤滤纸上，剪一张略长于且略宽于凝胶的保鲜膜放在凝胶纸上，剪一张略长于且略宽于凝胶的保鲜膜放在凝胶上。注意勿起褶皱及产生气泡。上。注意勿

26、起褶皱及产生气泡。用切纸刀将所有用切纸刀将所有3 3张张3MM3MM滤纸和保鲜膜修平使之大致与滤纸和保鲜膜修平使之大致与凝胶大小相同。凝胶大小相同。放于凝胶干燥机上真空放于凝胶干燥机上真空80 80 干燥干燥303040min40min从干燥机中取出凝胶并剥去保鲜膜。为了便于确定放从干燥机中取出凝胶并剥去保鲜膜。为了便于确定放射自显影片的方向，应在切去凝胶底角底部位贴上用射自显影片的方向，应在切去凝胶底角底部位贴上用放射性墨水标记底标签。放射性墨水标记底标签。室温对室温对X X光片曝光光片曝光161624h24h，进行放射自显影。，进行放射自显影。冲洗放射自显影胶片，读取冲洗放射自显影胶片，读

27、取DNADNA序列。序列。DNADNA序列测定技术序列测定技术四、从凝胶底放射自显影片上读限度四、从凝胶底放射自显影片上读限度DNADNA序列序列放射自显影片冲洗完毕后，马上标上日期、模板名称放射自显影片冲洗完毕后，马上标上日期、模板名称及各测序反应的名称。及各测序反应的名称。确认凝胶的左右，放射性墨水的影像应在最先加样的确认凝胶的左右，放射性墨水的影像应在最先加样的测序反应物第一泳道的底部。测序反应物第一泳道的底部。如果要搜寻新序列与已知序列之间的相应部位，可寻如果要搜寻新序列与已知序列之间的相应部位，可寻找显著的特征序列，如连续出现的相同核苷酸或交替找显著的特征序列，如连续出现的相同核苷酸

28、或交替出现的嘌呤和嘧啶，一旦找出这种序列，即可迅速确出现的嘌呤和嘧啶，一旦找出这种序列，即可迅速确定目的序列的位置。定目的序列的位置。未知序列至少应该两次并最好由不同的人来读，然后未知序列至少应该两次并最好由不同的人来读，然后对不同的阅读结果进行比较。如有必要，可再次测序对不同的阅读结果进行比较。如有必要，可再次测序加以确定。加以确定。DNADNA序列测定技术序列测定技术如果凝胶的加样次序如果凝胶的加样次序TCGATCGA，将放射自显影片翻转并从，将放射自显影片翻转并从底部读起，即可读取互补链（底部读起，即可读取互补链（3535）的序列。）的序列。阅读凝胶时的注意事项阅读凝胶时的注意事项 C

29、C的带常常比其他的带常常比其他3 3种核苷酸的带弱种核苷酸的带弱 连续出现的同聚连续出现的同聚A A中的第一个中的第一个A A一般比另几个一般比另几个A A要强要强 连续出现的同聚连续出现的同聚C C中的第一个中的第一个C C通常比第二个通常比第二个C C要弱得多要弱得多 在在T T之后出现的之后出现的G G带较弱带较弱DNADNA序列测定技术序列测定技术DNADNA序列测定技术序列测定技术以以M13M13噬菌体为载体的双氧链终止法测序反应噬菌体为载体的双氧链终止法测序反应1 1M13M13噬菌体复制型双链噬菌体复制型双链DNADNA（RFDNARFDNA）的制备）的制备 为了将待测双链为了将

30、待测双链DNADNA进行克隆，必须制备进行克隆，必须制备M13mp18M13mp18或或M13mp19M13mp19复制型（闭环双链）复制型（闭环双链）DNADNA。从从M9M9培养基中，挑起单个克隆大肠杆菌，培养基中，挑起单个克隆大肠杆菌，JM101JM101到到50ml250ml2YTYT培养基中，培养基中，3737振荡过夜。稀释振荡过夜。稀释1ml1ml培养物培养物到到50ml250ml2YTYT培养中，于培养中，于3737振摇振摇6h6h，转移，转移2ml2ml培养物培养物于微量离心管中，于微量离心管中，12000g12000g，离心，离心5min5min细菌沉淀保留用细菌沉淀保留用于

31、分离复制型于分离复制型RFDNARFDNA，上清用于分离噬菌体单链，上清用于分离噬菌体单链DNADNA。DNADNA序列测定技术序列测定技术2 2重组噬菌体制备重组噬菌体制备 采用多克隆位点上的限制性内加酶切割待测采用多克隆位点上的限制性内加酶切割待测DNADNA，并，并采用相同内切酶切割采用相同内切酶切割M13M13噬菌体噬菌体RFDNARFDNA（采用（采用BiolBiol 101gene clean 101gene clean 试剂盒分别纯化内切酶切割后的试剂盒分别纯化内切酶切割后的DNADNA片段），然后将待测外源片段），然后将待测外源DNADNA片段与片段与M13M13复制型载体复制

32、型载体DNADNA连接过夜，连接反应物转染连接过夜，连接反应物转染JM101JM101感受态细菌，将连接感受态细菌，将连接物物10l10l与与200l200l感受态细菌混匀，放置冰上感受态细菌混匀，放置冰上404050min50min，再放在，再放在4242水浴水浴2min2min，然后加入，然后加入1ml1ml新鲜的静新鲜的静止相止相JM101JM101培养物混匀，然后分别以培养物混匀，然后分别以300l300l于含有于含有IPIGIPIG（200mg/ml200mg/ml）和）和X-gal200mg/mlX-gal200mg/ml的的2 2YTYT培养基上，于培养基上，于3737培养培养8

33、h8h即可出现蓝色和白色噬斑，白色或称无菌即可出现蓝色和白色噬斑，白色或称无菌噬斑，即为阳性重组噬菌体。噬斑，即为阳性重组噬菌体。DNADNA序列测定技术序列测定技术3 3单链噬菌体单链噬菌体DNADNA（模板（模板DNADNA）的制备）的制备 上述平板的每个白色噬菌斑是由一种重组上述平板的每个白色噬菌斑是由一种重组M13DNAM13DNA分分子转染细菌后产生的，如果取一个白色噬菌斑进行培子转染细菌后产生的，如果取一个白色噬菌斑进行培养便可得到一种单链形式的养便可得到一种单链形式的DNADNA。为此，挑取一个白色。为此，挑取一个白色噬菌斑转接到一个新鲜制备的噬菌斑转接到一个新鲜制备的OD600

34、=0.1OD600=0.1的大肠杆菌的大肠杆菌JM101JM101培养物中，于培养物中，于3737振摇振摇5h5h左右，左右，12000g12000g离心离心10min10min，上清转移到另一新微量离心管中用于分离单链，上清转移到另一新微量离心管中用于分离单链DNADNA，按，按1ml1ml上清液中加入含上清液中加入含20%20%聚乙二醇聚乙二醇PEG-6000PEG-6000的的2.5m NaCl2.5m NaCl 200l 200l沉淀噬菌体，再用饱和酚抽提除去沉淀噬菌体，再用饱和酚抽提除去噬菌体蛋白，最后用噬菌体蛋白，最后用1/101/10体积的体积的3ml NaAc3ml NaAc和

35、乙醇沉淀和乙醇沉淀单链单链DNADNA，浓度调至，浓度调至0.10.10.5g/l0.5g/l。DNADNA序列测定技术序列测定技术4 4引物制备引物制备 购买通用引物或实验室合成购买通用引物或实验室合成15bp15bp26bp26bp长度的引物，长度的引物，通常以通常以2g/ml2g/ml的浓度贮存于的浓度贮存于-20-20备用。备用。5 5微量滴板微量滴板 进行大批量的模板测序时，常在密闭的微量离心管进行大批量的模板测序时，常在密闭的微量离心管中进行与引物的退火反应，然后在微量滴板中进行链中进行与引物的退火反应，然后在微量滴板中进行链延伸延伸-链终止反应。链终止反应。6 6变性聚丙烯酰胺凝

36、胶变性聚丙烯酰胺凝胶 测序凝胶装置的大小形状均不相同，其主要参数有：测序凝胶装置的大小形状均不相同，其主要参数有：长度通常为长度通常为404050cm50cm；宽度通常为宽度通常为20cm20cm；厚度厚度通常为通常为0.30.30.4mm0.4mm；横截面形状为楔形或锥形，即横截面形状为楔形或锥形，即顶部薄，底部厚，或者是将底部凝胶缓冲液的浓度提顶部薄，底部厚，或者是将底部凝胶缓冲液的浓度提高；高；加样槽；加样槽；整块凝胶上的温度应均一。整块凝胶上的温度应均一。DNADNA序列测定技术序列测定技术7 7电泳后将凝胶干燥，放射自显影电泳后将凝胶干燥，放射自显影8 8凝胶上读取凝胶上读取DNAD

37、NA序列序列此时读取的是目的此时读取的是目的DNADNA的互补链的互补链3355的序列。的序列。DNADNA序列测定技术序列测定技术第三节第三节 全自动激光荧光全自动激光荧光DNADNA测序测序 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。自动测序仪的设计原理是采用荧光标记DNA片段，并用激光激活的荧光探测系统，检测序列反应的分离产物，读出电泳条带所示的碱基顺序。分离产物有两种基本方法：单荧光标记四单荧光标记四泳道分离泳道分离和四荧光标记的单泳道分离四荧光标记的单泳道分离。DNADNA序列测定技术序列测定技术四荧光标记的单泳道分离的测序原理四荧光标记的单泳道分离的

38、测序原理 四标记单泳道法：ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的引物，4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。DNADNA序列测定技术序列测定技术荧光标记物ddGTPddATPddTTPddCTPDNADNA序列测定技术序列测定技术聚合反应及产物OH 3P 55PHODNA聚合酶，聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5PddATPddGTP5PddTTP5PddCTP5PDNADNA序列测定技术序列测定技术单泳道电泳及信号收集单泳道电泳及信号收集正极正极负极负极DNADNA序列测定技术序列测定技术计算机排序计算机排序5DNADNA序列测定技术序列测定技术