水产病害学第6章.ppt

1、 摇动摇动 15-20min 15-20min 44可保存可保存3 3周周 取适量取适量 NSNS洗涤洗涤3 3次次 2000r/min 2000r/min 10min 10minNSNS稀释至稀释至 2 25%5%液体培养或液体培养或 斜面培养斜面培养 3724h3724h100100水浴水浴 2 22.5h 2.5h 杀菌杀菌无菌试验无菌试验NSNS稀释成稀释成8 81010亿亿/ml/mlO O菌体抗原菌体抗原返回返回 可溶性抗原可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸 来源来源:主要是组织和细胞

2、，其成分也比较复杂。主要是组织和细胞，其成分也比较复杂。(一一).).组织和细胞可溶性抗原的制备组织和细胞可溶性抗原的制备 (二二).).蛋白质的提纯蛋白质的提纯 (三三).).免疫球蛋白片段的制备免疫球蛋白片段的制备 (四四).).纯化抗原的鉴定纯化抗原的鉴定 返回返回 (一一).组织和细胞可溶性抗原的制备组织和细胞可溶性抗原的制备 常用酶类：常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：方法：在一定的条件下，能消化细菌和在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞组织细胞 特点：特点：此法适用多种微生物；此法适用多种微生物；具有作用条件温和；具有作用条件温和；内含物成分不

3、易受到破坏；内含物成分不易受到破坏；细胞壁损坏的程度可以控制。细胞壁损坏的程度可以控制。原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生的空化作用（由于超声波发生的空化作用（cavitation）使得液）使得液 体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成 与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波 所使用的频率从所使用的频率从1kHz20kHz不等，间歇进行，避免不等，间歇进行，避免 长期超声产热，导致抗原破坏。长期超声产热，导致抗原破坏。特点：特点：操作简

4、单，重复性较好，节省时间；操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。多用于微生物和组织细胞的破碎。原理：原理：在适当的温度、在适当的温度、pHpH及低离子强度的条及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。使膜的渗透性改变或使之溶解。常用的有：常用的有：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS,(SDS,阴离子型阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。（非离子型）、新洁尔灭等。应用：应用：破碎细菌，且作用比较温和；破碎细菌，且作用

5、比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。提取核酸时，常用此法破碎细胞。返回返回 蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的 抗血清通常需要纯化。可采用如下方法：抗血清通常需要纯化。可采用如下方法：1.1.超速离心法超速离心法 2.2.选择性沉淀法选择性沉淀法 3.3.凝胶层析法凝胶层析法 4.4.离子交换层析法离子交换层析法 5.5.亲合层析法亲合层析法 原理原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不利用各颗粒在梯度液中沉降速度不 同，使具有不同沉降速度的颗粒同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同处于不同 密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。密度的梯度层内，达到彼此分离

6、的目的。特点：特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如的抗原物质的分离，如IgMIgM、C1qC1q、甲状腺球、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白蛋白、载脂蛋白A A、B B等。等。原理：原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法：常用方法

7、：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用度不同）；常用33335050饱和度的硫酸胺。饱和度的硫酸胺。特点：特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。在大量制备中先用此法粗提，再纯化。原理：原理：凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当的溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种经适当的溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分分 子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗物质不能

8、进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受构内，反复受 到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、小三种类型。小三种类型。特点：特点：简单易行，但掌握不好，分离效果较差。简单易行，但掌握不好，分离效果较差。原理：原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能

9、电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。原理：原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗提纯的技术。将纯化的抗IgGIgG附着于惰性的固附着于惰性的固相基质上，

10、制成免疫吸附层析柱。当样品流过相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的此柱时，待分离的IgGIgG可选择性地与免疫吸附可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体剂上的特异性配体(抗抗 IgGIgG)结合；当改变洗脱结合；当改变洗脱条件可重新解离，从而将待分离的免疫球蛋白条件可重新解离，从而将待分离的免疫球蛋白洗脱下来，达到纯化的目的。洗脱下来，达到纯化的目的。优点：优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。提取纯度高、抗原抗体不失活性。大分子的核酸具有免疫原性。大分子的核酸具有免疫原性。提取核酸的主要步骤：提取核酸的主要步骤：破碎细胞破碎细胞核酸从细胞中游离出来核酸从细胞中游离出来酸沉淀核

11、酸沉淀核除去蛋白质除去蛋白质乙醇乙醇酚和氯仿酚和氯仿苯酚法提取苯酚法提取LPSLPS：干燥菌体干燥菌体或湿菌体或湿菌体水中水中 混匀混匀激烈搅匀激烈搅匀 加热加热5min5min冰水冰水 急冷急冷降至降至1010以下以下离心离心上层的水层上层的水层(含含LPS)LPS)下层的酚层下层的酚层 菌体残渣于底部菌体残渣于底部吸取吸取 水层水层透析透析 除酚除酚加热加热超速离心超速离心浓缩浓缩LPS LPS 在上层在上层沉淀的透明沉淀的透明胶状部内胶状部内绞出绞出悬于水中悬于水中离心离心得纯化得纯化LPSLPS同温的苯酚同温的苯酚1 1酶裂解法酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好酶对免疫球蛋白的水解有

12、极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。为不同的片段。2 2氧化法和还原法氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。链分开的两种常用方法。3.3.还可用强变性剂或利用改变还可用强变性剂或利用改变pHpH将免疫球蛋将免疫球蛋 白亚单位分开。白亚单位分开。FcFc段，用段，用以制备抗以制备抗重链血清重链血清F(ab)F(ab)2 2，常作为抗常作为抗体试剂用体试剂用于试验于试验木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 （papainpapain)胰蛋白酶胰蛋白酶 (pepsin)(pepsin)胃蛋白酶胃蛋白酶 (pepsin

13、)(pepsin)(四四)纯化抗原的鉴定纯化抗原的鉴定 1.1.含量鉴定含量鉴定 2.2.分子量鉴定分子量鉴定凝胶层析技术进行测定凝胶层析技术进行测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳凝胶管状电泳 超速离心超速离心 3.3.纯度鉴定：纯度鉴定：免疫电泳，醋酸纤维膜电泳免疫电泳，醋酸纤维膜电泳 4.4.免疫活性鉴定：免疫活性鉴定：常用双向琼脂扩散试验常用双向琼脂扩散试验 人工抗原：是指经过人工修饰后具有免疫原性人工抗原：是指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原。如：低分子量的化学物质。例如多的半抗原。如：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷糖、多肽、

14、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等包括抗生素）及其他化学物品等。碳化二亚胺法：碳化二亚胺法：R-NH=CH-RR-NH=CH-R 半抗原载体蛋白质半抗原载体蛋白质 搅拌搅拌1 12h2h 室温室温2424h h透吸除去未反透吸除去未反应的半抗原应的半抗原人工免疫原人工免疫原混合混合混合混合戊二醛法戊二醛法:半抗原半抗原-NH-NH2 2 载体蛋白载体蛋白-NH-NH2 2半抗原半抗原-N=-N=CH-(CHCH-(CH2 2)3 3-CH=-CH=NH-NH-载体蛋白载体蛋白OHC-(CHOHC-(CH2 2)3 3-CHO-CHO*戊二醛是常用的

15、带有两个活性基团的双戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂功能联接剂氯甲酸异丁脂法：氯甲酸异丁脂法：半抗原半抗原-COOH-COOH 载体蛋白载体蛋白-NH-NH2 2Cl-COO-CHCl-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2半抗原半抗原-COO-COO-CH-COO-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2 半抗原半抗原-CO-CO-NHNH-载体蛋白载体蛋白 简便，用于类固醇抗原制备简便，用于类固醇抗原制备HO-HO-CHCH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2琥珀酸酐法：琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备用于不含羧基衍生物半抗原制备 半抗原

16、半抗原-CH-CH2 2OHOHCHCH2 2-CO -CO CHCH2 2-CO-CO 带羧基的半抗原带羧基的半抗原琥珀酸衍生物琥珀酸衍生物 半抗原半抗原-CH-CH2 2-OOC-CH-OOC-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH 返回返回 吡啶吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原二亚胺法制备载体半抗原1.1.氢氧化铝佐剂：氢氧化铝佐剂：5%5%硫酸铝硫酸铝5%5%氢氧化钠氢氧化钠氢氧化氢氧化铝沉淀铝沉淀制成悬液制成悬液 即为佐剂即为佐剂强烈搅拌强烈搅拌NSNS洗洗 二次二次NSNS等体积抗原等体积抗原免疫接种免疫接种10%10%硫酸钾铝

17、硫酸钾铝氢氧化钠校正氢氧化钠校正pHpH值至值至6.56.5沉淀沉淀乳状悬液乳状悬液*明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。易引起肉芽种和脓肿。NSNS搅拌搅拌NSNS洗洗 二次二次离心离心抗原抗原备用备用防腐剂防腐剂作用大于不完全佐剂作用大于不完全佐剂 局部形成肉芽种和溃疡局部形成肉芽种和溃疡 不能用于人体不能用于人体 弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂液体石蜡液体石蜡完全完全乳化乳化备用备用高压高压 灭菌灭菌加热加热抗原抗原弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂卡介苗卡介苗羊毛脂羊毛脂鉴定鉴定一滴一滴 乳剂乳剂乳剂不散乳剂不散浮于液面浮于液面水中水中

18、混合混合一一.选择免疫动物选择免疫动物 二二.免疫方法免疫方法 三三.动物采血法动物采血法 四四.免疫血清的纯化免疫血清的纯化 五五.抗血清的鉴定与保存抗血清的鉴定与保存 (一一).).免疫原的注射剂量免疫原的注射剂量 (二二).).免疫间隔时间：首次与二次尤为重要，免疫间隔时间：首次与二次尤为重要，整免疫过程整免疫过程5 5至至8 8次。次。(三三).).免疫途径：免疫反应产生速度依次为静免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌脉腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌 1.1.颈动脉放血法：羊、兔最常用的方法颈动脉放血法：羊、兔最常用的方法 2.2.静脉采血法静脉采血法：羊、兔，小

19、鼠断尾或眼球：羊、兔，小鼠断尾或眼球 3.3.心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡(一一)特异性抗体的纯化特异性抗体的纯化 1.亲合层析法：将交叉抗原交联到亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体。，杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，杂抗原则与杂抗体结合接加到免疫血清中，杂抗原则与杂抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。，上清液则为无杂

20、抗体的单价特异性抗体。A.无菌生理盐水无菌生理盐水 B.抗原抗原(颗粒抗原颗粒抗原)C.抗体抗体敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ngng/ml/ml水平水平包被的条件包被的条件ELISA的试剂准备的试剂准备B 试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用

21、酸终止酶反应后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结结合物最常用的底物。合物最常用的底物。DH2+H2O2 D+2H2O 上式中，上式中，DH2为供氧体，为供氧体，H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺、四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS。（六）（六）对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive co

22、ntrol)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative control)(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。标本物质的量。

23、加样加样:（七）基本操作注意事项（七）基本操作注意事项保温保温洗涤洗涤显色显色比色比色（八）（八）结果判断结果判断 6.1 6.1 定性测定定性测定A.A.阳性判定值：阳性判定值：（cut-off valuecut-off value）一般为阴性对照一般为阴性对照A A值加上一个特定的常数值加上一个特定的常数(0.05)(0.05)，以此作为判断结果，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。阳性或阴性的标准。B.B.标本标本/阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（标

24、本（S S）和阴性对照（）和阴性对照（N N）的）的A A值后，计算值后，计算S/NS/N值。值。间接法和夹心法间接法和夹心法（2 2）竞争法）竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出一般均用比色计测定，读出S S、P P和和N N的吸光值。的吸光值。a.a.阳性判定值法阳性判定值法 阳性判定值阳性判定值=0.4=0.4NCX+0.6NCX+0.6PCXPCX 阳性阳性 AA阳性判定值阳性判定值 阴性阴性 A A阳性判定值阳性判定值 b.b.抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（%）=（阴性对照（阴性对照A A值值-标本标本A A值）值）100%/100%/阴性阴性对照对照 阳性阳性 抑制率抑制率50%50%阴性阴性 50%50%图6-5 PCR原理示意图 CK(ul)1#(ul)模板01引物10.40.4引物20.40.410 PCR Buffer22Taq酶0.50.5dNTPs0.40.4ddH2O14.315.3Total2020PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）