层析技术讲义.docx
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《层析技术讲义.docx》由用户(最好的沉淀)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 层析 技术 讲义
- 资源描述:
-
1、层析技术讲义层析法又称色层分析法或色谱法( Chromatography),它是在1903-1906 年由俄国植物学家M. Tswett 首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3 管柱,并继续以石油醚淋洗,由于 CaCO3 对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图(Chromatogram)。当时这种方法并没引起人们的足够注意,直到 1931 年将该方法应用到分离复杂的有机混合物,人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要,层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin 和Synge。
2、他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论,以理论塔板来表示分离效率,定量的描述、评价层析分离过程。其次,他们根据液液逆流萃取的原理,发明了液液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言:一、流动相可用气体代替液体, 与液体相比,物质间的作用力减小了,这对分离更有好处;二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差,应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数),这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生,并在 1952 年诞生了气相色谱仪,它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革;后者预见了高效液相色谱(HPLC)的产生,在60 年代末也为人们所实现,现在
3、HPLC 已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin 和Synge 于 1952 年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质,已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。层析法的最大特点是分离效率高,它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定,又可用于大量物质的分离纯化制备。因此,作为一种重要的分析分离手段与方法,它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在,它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。 一、层析的基
4、本理论层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同, 使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如: 我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差 异,使其在流动相与固定相之间的分配系数(或称分配常数)不同, 达到彼此分离的目的。对于一个层析柱来说,可作如下基本假设:1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的,而且层析柱由若干层组成。每层高度为H,称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据, 一部分为流动相占据,且各塔板的流动相体积相等,称为板体积,以Vm 表示。2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动
5、相之间瞬间达到平衡,且忽略分子纵向扩散。3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数,与溶质在塔板的量无关。4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程(即不连续过程)。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为 Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V 时,则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:n =5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定,将连续的层析过程分解成了间歇的动作,这与多次萃取过程相似,一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。3.1.3 层析的基本概念1. 固定相:固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂,凝胶, 离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液
6、),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附,溶解,交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。2. 流动相:在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等,都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂, 薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。3. 分配系数及迁移率(或比移值):分配系数是指在一定的条件下,某种组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比值,常用K 来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。K=Cs/Cm其中Cs: 固定相中的浓度,Cm: 流动相中的浓度。迁移率(或比移值)是指:在一定条件下,在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流
7、动相本身移动的距离之比值。常用 Rf 来表示。实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指:在一定条件下,在相同时间内,某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1,也可以大于1。用Rx 来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然,差异越大,分离效果越理想。分配系数主要与下列因素有关:被分离物质本身的性质;固定相和流动相的性质;层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式:lnK = G0/RT) D(式中: K 为分配系数(或平衡常数) G0 为标准自由能变化DR 为气体
8、常数T 为绝对温度C,G0 为负值,则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20D 这是层析分离的热力学基础。一般情况下,层析时组分的 K 值下降一半,它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于 K 值相近的不同物质,可通过改变温度的方法,增大K 值之间的差异,达到分离的目的。4. 分辨率(或分离度)分辨率一般定义为:相邻两个峰的分开程度。用 Rs 来表示。Rs 值越大,两种组分分离的越好。当 Rs = 1 时,两组分具有教好的分离,互相沾染约 2%,即每种组分的纯度约为 98%。当 Rs=1.5 时,两组分基本完全分开,每种组分的纯度可达到99.8%。如果两
9、种组分的浓度相差较大时,尤其要求较高的分辨率。为了提高分辨率Rs 的值,可采用以下方法: 使理论塔板数N 增大,则Rs 上升。 增加柱长,N 可增大,可提高分离度,但它造成分离的时间加长, 洗脱液体积增大,并使洗脱峰加宽,因此不是一种特别好的办法。 m 以下,且压力可达 150kg/cm。它使Rs 大大提高,也使分离的效率大大提高了。mm;而 HPLC 柱子的固定相颗粒为 10m减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸,并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100 采用适当的流速,也可使理论塔板的高度降低,增大理论塔板数。太高或太低的流
10、速都是不可取的。对于一个层析柱,它有一个最佳的流速。特别是对于气相色谱,流速影响相当大。 改变容量因子D(固定相与流动相中溶质量的分布比)。一般是加大 D,但 D 的数值通常不超过 10,再大对提高 Rs 不明显,反而使洗脱的时间延长,谱带加宽。一般 D 限制在 1 D 10,最佳范围在 1.5-5 之间。我们可以通过改变柱温(一般降低温度),改变流动相的性质及组成(如改变 pH 值,离子强度,盐浓度,有机溶剂比例等),或改变固定相体积与流动相体积之比(如用细颗粒固定相, 填充的紧密与均匀些),提高D 值,使分离度增大。a(分离因子,也称选择性因子,是两组分容量因子D 之比),使Rs 变大。实
11、际上,使 a 增大 a增大,就是使两种组分的分配系数差值增大。同样,我们可以通过改变固定相的性质、组成,改变流动相的性质、组成,或者改变层析的温度,使a发生改变。应当指出的是,温度对分辨率的影响,是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高,理论塔板高度有时会降低,有时会升高,这要根据实际情况去选择。通常, 的变化对Rs 影响最明显。总之,影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑,特别是对于生物大分子,我们还必须考虑它的稳定性,活性等问题。如 pH 值、温度等都会产生较大的影响,这是生化分离绝不能忽视的。否则,我们将不能得到预期的效果。5. 正相色谱与反相色
12、谱正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性,因此,在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快, 先从柱中流出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性,在这种层析过程中,极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说,分离纯化极性大的分子(带电离子等)采用正相色谱(或正相柱),而分离纯化极性小的有机分子(有机酸、醇、酚等)多采用反相色谱(或反相柱)。6. 操作容量(或交换容量)在一定条件下,某种组分与基质(固定相)反应达到平衡时,存在于基质上的饱和容量,我们称为操作容量(或交换容量)。它的单位是毫摩尔(或毫克)/克(基质)或毫摩尔(或毫克)/毫升(基
13、质), 数值越大,表明基质对该物质的亲合力越强。应当注意,同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的,这主要是由于分子大小(空间效应)、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此,实际操作时,加入的样品量要尽量少些,特别是生物大分子,样品的加入量更要进行控制,否则用层析办法不能得到有效的分离。3.1.4 层析法的分类层析根据不同的标准可以分为多种类型:1. 根据固定相基质的形式分类,层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层,在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形,在柱中进行层析。纸层析和薄层层析
14、主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备,通常为一次性使用,而柱层析是常用的层析形式,适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。2. 根据流动相的形式分类,层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析,而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化,大大限制了其在生化领域的应用, 主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式,适于生物样品的分析、分离。3. 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲
15、和层析等。吸附层析是以吸附剂为固定相,根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中,不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相,根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。离子交换层析是以离子交换剂为固定相,根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力(如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等),将某种配体连接在载体上作为固定相,而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析
16、技术,具有很高分辨率。3.1.5 柱层析的基本装置及基本操作目前,最常用的层析类型是各种柱层析,下面就简述柱层析的基本装置及操作方法,薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。1. 柱层析的基本装置2. 柱层析的基本操作柱层析的基本操作包括以下一些步骤: 装柱柱子装的质量好与差,是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀,不能分层,柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。首先选好柱子,根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为 1:1050;凝胶柱可以选 1:100200,同时将柱子洗涤干净。将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀,并用
17、适当浓度的酸(0.5N1N)、碱(0.5N1N)、盐(0.5M1M) 溶液洗涤处理,以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起),以除去其内部的气泡。关闭层析柱出水口,并装入 1/3 柱高的缓冲液,并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中,使其沉降约 3cm 高。打开出水口,控制适当流速,使吸附剂等均匀沉降,并不断加入吸附剂溶液。(吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。)注意不能干柱、分层,否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有 23cm 高的缓冲液,同时关闭出水口。(采用机械化装柱法在此省略。) 平衡柱子装好后,要用所需的缓冲液
18、(有一定的pH 和离子强度)平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子(平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同)。平衡液体积一般为35 倍柱床体积,以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要,可用兰色葡聚糖 2000 在恒压下走柱,如色带均匀下降,则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后, 还要进行转型处理。这方面的内容在离子交换层析中加以介绍。 加样加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲,加样量尽量少些, 分离效果比较好。通常加样量应少于 20%的操作容量,体积应低于 5% 的床体积,对于分析性柱层析,一般不超过床体积的 1%。当然,最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。应注意的是,加样时应缓
19、慢小心地将样品溶液加到固定相表面, 尽量避免冲击基质,以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。 洗脱当我们选定好洗脱液后,洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱:柱子始终用同样的一种溶剂洗脱,直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大,其区带的洗脱时间间隔(或洗脱体积间隔)也不长,采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。分步洗脱:这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液, 进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。梯度
20、洗脱:当混合物中组分复杂且性质差异较小时,一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的,梯度可以指浓度、极性、离子强度或 pH 值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中,亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种。洗脱条件的选择,也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时,一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试, 但梯度的斜率要小一些,尽管洗脱时间较长,但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到,流速的快慢将影响理论塔板高度,从而影响分辨率。事实上,速度太快, 各组分在固液两相中平衡时间短,相互分不开,仍以混合组分流出。速度太慢,将增大物质的扩散,同
21、样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之,我们必须经过反复的试验与调整(可以用正交试验或优选法),才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是,在整个洗脱过程中,千万不能干柱,否则分离纯化将会前功尽弃。 收集、鉴定及保存在生化实验中,基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限,洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此,每管的收集量不能太多,一般 1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近,可低至 0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前,还要进行鉴定。例如,一个蛋白峰的各管溶液,我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单
22、条带的,认为已达电泳纯,合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法,在这里不再叙述。最后,为了保持所得产品的稳定性与生物活性,我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩, 再冰冻干燥,得到干粉,在低温下保存备用。 基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的再生许多基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)可以反复使用多次,而且价格昂贵,所以层析后要回收处理,以备再用,严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。3.2 凝胶层析3.2.1 简介凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel ex clusion
23、chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chrom atography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。它是以多孔性凝胶填料为固定相, 按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959 年,Porath 和Flodin 首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料, 分离水溶液中不同分子量的样品,称为凝胶过滤。1964 年,Moore 制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶,能够进行有机溶剂中的分 离,称为凝胶渗透层析(流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层
24、析)。随后这一技术得到不断的完善和发展,目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段,它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点,因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化,同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。3.2.2 凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大
展开阅读全文