微生物的实验室培养.ppt

1、微生物实验室培养的基本操作程序微生物实验室培养的基本操作程序1.1.器具的灭菌器具的灭菌2.2.培养基的配制培养基的配制3.3.培养基的灭菌培养基的灭菌4.4.倒平板倒平板5.5.微生物接种微生物接种6.6.恒温箱中培养恒温箱中培养7.7.菌种的保存菌种的保存四、实验操作四、实验操作(一一)制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌用于培养细菌)四、实验操作四、实验操作(一一)制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌用于培养细菌)牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏牛肉膏 5.0g蛋白胨蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g琼脂琼脂 20.

2、0g将上述物质溶解后，添加自来水，定将上述物质溶解后，添加自来水，定容至容至1000mL1计算、称量计算、称量2溶化溶化3调调pH：pH764过滤：这一步可以省去。过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞加塞7包扎包扎操作步骤操作步骤8灭菌灭菌:将将50ml培养基用玻棒转移至三角培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，

3、再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为、温度为121，灭菌，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在入干热灭菌箱内，在160170 下灭下灭菌菌2h。倒平板技术倒平板技术1.将灭过菌的将灭过菌的培养皿放在火培养皿放在火焰旁的桌面上，焰旁的桌面上，右手拿装有培右手拿装有培养基的锥形瓶，养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。左手拨出棉塞。1234倒平板技术倒平板技术2.右手拿锥形右手拿锥形瓶，使瓶口迅瓶，使瓶口迅速通过火焰。速通过火焰。1234倒平板技术倒平板技术12343.用左手的拇指用左手的拇指和食指将培养皿和食指

4、将培养皿打开一条稍大于打开一条稍大于瓶口的缝隙，右瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的手将锥形瓶中的培养基培养基(约约1020mL)倒入培养倒入培养皿，左手立即盖皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。上培养皿的皿盖。倒平板技术倒平板技术12344.等待平板冷等待平板冷却凝固，大约却凝固，大约需需510min。然后，将平板然后，将平板倒过来放置，倒过来放置，使皿盖在下，使皿盖在下，皿底在上。皿底在上。9倒平板倒平板:待培养基冷却到待培养基冷却到50 左右时，在酒左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接后观察平板，无杂菌污染才可用来接

5、种种.10无菌检查：无菌检查：将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37的温室中培的温室中培养养2448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。实验操作录像实验操作录像 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？法来估计培养基的温度？问题讨论问题讨论 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，

6、感觉锥形瓶的温度下降的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。板了。问题讨论问题讨论 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？过火焰？2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面凝结水珠，凝

7、固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？4.在倒平板的过程中，如果不小在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？位，这个平

8、板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？答：空气中的微生物可能答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培生，因此最好不要用这个平板培养微生物。养微生物。（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法和稀释涂布平板法微生物的接种技术：微生物的接种技术：平板划线的操作方法平板划线的操作方法 一旦划破，会造成划线不均匀，一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破

9、形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。一旦划破，会造成划线不均匀，一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。实验操作录像实验操作录像问题讨论问题讨论 1.为什么在操作的第一步以及每为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时线操作结束时,仍然需要灼烧接种环仍然需要灼烧接种环吗

10、？为什么？吗？为什么？答：第一步灼烧是为了避免接种环答：第一步灼烧是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后，划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源上次划线的末接种环上的菌种直接来源上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧，能及时杀死接菌落。划线结束后灼烧，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境

11、种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？其冷却后再进行划线？2.在灼烧接种环之后，为什么要等在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀答：以免接种环温度太高，杀死菌种。死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？端开始划线？3.在作第二次以及其后的划线操在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末作时，为什么总是从上一次划线的末端开始

12、划线？端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。来的菌落。稀释涂布平板法稀释涂布平板法1.将分别盛有将分别盛有9mL水的水的6支试管灭菌，支试管灭菌，并按并按101106的顺序编号。的顺序编号。2.用移液管吸取用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮二支试管中。用手指轻压移液管

13、上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。3.从从101倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注稀释液，注入入102倍稀释的试管中，重复第倍稀释的试管中，重复第2步的操作。步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。注意：注意：移液管需要经过灭菌。操作时，移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰试管口和移液管离火焰12cm处处.涂布平板的所有操作都应在火焰附涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第菌操作要求，想一想，第2

14、步应如何进行步应如何进行无菌操作？无菌操作？问题讨论问题讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第菌操作要求，想一想，第2步应如何进行步应如何进行无菌操作？无菌操作？应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无无菌菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题讨论问题讨论微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养

15、微生物的恒温培养微生物的恒温培养菌种的保存菌种的保存1.临时保藏临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后置养基，菌落长成后置于于4冰箱保存。冰箱保存。2.长期保存长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法四、课题成果评价四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中如果未接种的培养基在恒温箱中保温保温12 d后无菌落生长，说明培后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重养基的制备是成功的，否则需要重新制备。新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、如果培养基上生

16、长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养培养12 h与与24 h后的大肠杆菌菌落的后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微会发现

17、这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。好的科学态度与习惯。例例1.有关微生物营养物质的叙述中，正有关微生物营养物质的叙述中，正 确的确的()A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量典例解析典例解析例例1.有关微生物营养物质的叙述中，正有关微生物营养物质的叙述中，正 确的确的()A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都

18、提供能量凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量典例解析典例解析D例例2.下面对灭菌的理解不正确的是下面对灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染防止杂菌污染B.消灭杂菌消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前例例2.下面对灭菌的理解不正确的是下面对灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染防止杂菌污染B.消灭杂菌消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前B编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫1

19、0g（NH4）2SO40.4gK2HPO44.0gMgSO49.25gFeSO40.5gCaCl20.5gH2O100ml例例3右表是某微右表是某微生物培养基成分，生物培养基成分，请据此回答：请据此回答：（1）右表培养基）右表培养基可培养的微生物类可培养的微生物类型是型是_.例例3右表是某微右表是某微生物培养基成分，生物培养基成分，请据此回答：请据此回答：（1）右表培养基）右表培养基可培养的微生物类可培养的微生物类型是型是_.自养型微生物自养型微生物 编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g（NH4）2SO40.4gK2HPO44.0gMgSO49.25gFeSO40.5gCaCl20.5gH2O100ml