分子生物学常用技术(简化版)课件.ppt

1、同位素半衰期比活性用途特点32P14.3 天9120D N A放射性强35S87.1 天1490D N A/蛋白3H12.1 年29D N A/蛋白分辨率高125I60 天2400蛋白标记简单标记方法标记物探针缺口平移同位素或半抗原DNA 探针随机引物标记同位素或半抗原DNA 探针5或3末端标记同位素寡核苷酸探针PCR标记同位素或半抗原DNA 探针体外转录同位素或半抗原单链 RNA 探针化学标记半抗原均可转膜DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNADNA解解旋解链旋解链ATCGCGAT

2、AGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA解解旋解链旋解链引物引物合成合成DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解解旋解链旋解链引物引物合成合成新链新链延伸延伸DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC

3、53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35变性复性加热退火DNA加热解链模板DNA9455引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第1轮结束94第2轮开始72TaqTaqTaqTaq55第2轮结束重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性新链延伸DNA的体外扩增热循环DNA解链PCR反应体系4种dNTP混合物 各200 mol/L引物 各0.1-0.5 mol/L模板DNA 0.12 gTaq DNA聚合酶 2.5 UMg2+1.5mmol/LDNA的体外扩增DNA聚合酶催化的聚合反应dNTP53