免疫学检验-6-补体参与的反应课件.ppt
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- 免疫学 检验 补体 参与 反应 课件
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1、第六章第六章 补体参与的反应补体参与的反应 1919世纪末,在发现体液世纪末,在发现体液免疫后不久,免疫后不久,BordetBordet即即证明,证明,新鲜血清中存在新鲜血清中存在不耐热的成分不耐热的成分,可辅助,可辅助特异性抗体介导的溶菌特异性抗体介导的溶菌作用。因其是抗体发挥作用。因其是抗体发挥溶细胞作用的必要补充溶细胞作用的必要补充条件,故被称为补体。条件,故被称为补体。Bordet SRBC+SRBC+抗抗SRBCSRBC抗体抗体 不溶血不溶血 SRBC+SRBC+抗抗SRBCSRBC抗体新鲜动物血清抗体新鲜动物血清 溶血溶血 SRBC+SRBC+抗抗SRBCSRBC抗体加热处理新鲜动
2、物血清抗体加热处理新鲜动物血清 不溶血不溶血 37 30min37 30min37 30min 补体(Complement,C):是正常存在于人或哺乳动物血清与组织液中的一组被激活后具有酶活性的蛋白质。性质不稳定,加热56 30min,可使其灭活。补体的激活途径:经典途径、替代途径、MBL途径C1分子结构图图1 抗原(抗原(antigen Ag)与抗体()与抗体(antibody Ab)结合形成免疫复合物)结合形成免疫复合物(immune complex IC)图图2 免疫复合物与补体结合,使补体发生作用。免疫复合物与补体结合,使补体发生作用。AgAgAgAg图图1图图2Ab补体(补体(com
3、plement)SRBC图图1 绵羊红细胞与溶血素(绵羊红细胞与溶血素(hemolysin)即抗绵羊红细胞结合,形成致敏)即抗绵羊红细胞结合,形成致敏绵羊红细胞(绵羊红细胞(SRBCs)。)。图图2 致敏绵羊红细胞与补体结合,使其激活,补体发生溶细胞作用,引致敏绵羊红细胞与补体结合,使其激活,补体发生溶细胞作用,引起红细胞肿胀,发生溶血。起红细胞肿胀,发生溶血。图图1图图2SRBCSRBC补体补体(complement)SRBCSRBChemolysinSRBCsSRBCs 第一节补体结合试验补体结合试验(complement fixation test,CFT):-是用免疫溶血机制做指示系统
4、,来检测 另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断,即著名的华氏反应。除了用于传染病诊断和流行病学调查以外,在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。一、免疫溶血反应 概念:是红细胞-抗体复合物激活补体,导致红细胞溶解的反应。参与成分:绵羊红细胞-SRBC抗SRBC抗体-溶血素补体 用途:测定血清总补体活性及单个补体成分功能活性。溶血素效价滴定。作为指示系统,参与补体结合试验。溶血素效价的测定溶血素效价的测定 试验原理试验原理:经绵羊红细胞(SRBC)免疫的动物(小鼠或家兔)血清中可出现抗SRBC的抗体。采集免疫动物血液分离血清,
5、即可获得抗SRBC的抗血清。当用SRBC与相应抗血清混合,有补体存在时,在一定条件下,SRBC被溶解破坏。因此抗SRBC抗体又称为溶血素。溶血素效价 使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀释度。免疫溶血反应的试剂 稀释缓冲液常用pH 7.2-7.4的PBS或BB:有利于AgAb结合和补体活化。加入适量NacCl:保持等渗和提供Ca2+Mg2+。补体:检测补体:采用新鲜血清。补体结合试验:采用新鲜豚鼠血清。绵羊红细胞:采用2%5%的SRBC悬液。用缓冲液配制。溶血素SRBC免疫家兔而得到的抗血清。试验前需灭活补体。溶血素稀释:按右表稀释。溶血素效价滴定:确定溶血素的效价(1个溶血素单位)。试
6、验时一般使用2个溶血素单位。溶血素稀释度及体积溶血素稀释度及体积稀释液稀释液(ml)溶血素最终溶血素最终稀释度稀释度稀释度稀释度 体积(体积(ml)11001001100010001100010001200020001100010001300030001400040001500050000.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.21.80.20.40.20.80.20.20.211000120001300014000150001600018000110000 按表将试剂加入试管后,按表将试剂加入试管后,37水浴水浴30min,观察结果。,观察
7、结果。以以完全溶血的溶血素最高稀释度完全溶血的溶血素最高稀释度为效价,本例中的溶血素为效价,本例中的溶血素效价为效价为1 4000,即为,即为1个溶血素单位个溶血素单位。试验时,用试验时,用2个个溶血素单位(在本例做溶血素单位(在本例做1 2000稀释)。稀释)。管号管号 溶血素稀释度溶血素稀释度各种试剂加入量各种试剂加入量(ml)结果结果溶血素溶血素 16060稀释补体稀释补体 缓冲液缓冲液 2%SRBC2%SRBC 1 11000 0.1 1000 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 全溶血全溶血 2 12000 0.1 2 12000 0.1 0.2 0.2 0.2
8、0.1 0.2 0.1 全溶血全溶血 3 13000 0.1 3 13000 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 全溶血全溶血 4 14000 0.1 4 14000 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 全溶血全溶血 5 15000 0.1 5 15000 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 大部分溶血大部分溶血 6 16000 0.1 6 16000 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 微溶血微溶血 7 18000 0.1 7 18000 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 不溶血不溶血 8
9、110000 0.1 8 110000 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 不溶血不溶血 9 110000(9 110000(对照对照)0.1 )0.1 0.40.40.10.1 不溶血不溶血一、CFT试验原理 有5种成分参与反应,分属于3个系统:反应系统:即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原);补体系统:指示系统:即SRBC与相应溶血素,试验时常将其预先结合在一起,形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统,先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。AgAb补体抗体阳性待检系统待检系统指示系统指示系统溶血反应溶血反应红细胞红细胞溶血素溶血素不溶血不溶血抗体阴性Ag
10、Ab补体红细胞红细胞溶血素溶血素溶血溶血补体结合补体结合试验试验阳性阳性阴性阴性二、试验方法较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法(塑板法)等。以后两种方法应用较为广泛,因为可以节省抗原,血清标本用量较少,特异性也较好。以下叙述以小量法为例:即抗原,抗体,溶血素,羊红细胞各加0.1ml,补体加0.2ml,总量为0.6ml。(一)试剂1抗原:试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯,纯度愈高,特异性愈强。如使用粗制抗原时,须经同样处理的正常组织作抗原对照,以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。2抗原和抗体的滴定:多采用方阵法进行滴定,选择适宜
11、的抗原与抗体浓度比例。选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应(100不溶血)的最高稀释度作为抗原和抗体的效价(单位)。正式试验中,抗原用24个单位,抗体用4个单位。抗原和抗体的方阵滴定抗原和抗体的方阵滴定 抗抗 原原抗抗 血血 清清 稀稀 释释 度度抗原抗原对照对照 1 14 4 1 18 8 1 116 16 1 132 32 1 164 64 1 1128 128 1 1256 256 1 15125121 14 4 4 4 4 4 4 3 2 04 4 4 4 4 4 4 3 2 01 18 4 4 4 4 4 3 2 1 08 4 4 4 4 4 3 2 1 01 116 4 4 4 4 3
12、 2 2 16 4 4 4 4 3 2 2 0 01 132 4 4 4 4 3 2 32 4 4 4 4 3 2 0 0 0 01 164 4 4 4 64 4 4 4 4 4 2 1 0 0 0 2 1 0 0 01 1128 4 2 1 0 0 0 0 0 0128 4 2 1 0 0 0 0 0 01 1256 3 1 0 0 0 0 0 0 0256 3 1 0 0 0 0 0 0 01 1512 0 0 0 0 0 0 0 0 0512 0 0 0 0 0 0 0 0 0抗血清对照抗血清对照 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0注:注:0表示表示100%溶血
13、,溶血,1表示表示75%溶血,溶血,2表示表示50%溶血,溶血,3表示表示25%溶血,溶血,4表示表示100%不溶血。不溶血。3、补体的滴定:一般用豚鼠补体,补体滴定按下表逐步加入各试剂,温育后观察最少量补体能产生完全溶血者,确定为1个实用单位,正式试验中使用2个实用单位。管管 号号 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6160160补体补体(ml)(ml)缓冲液缓冲液(ml)(ml)2U/ml2U/ml抗原抗原(ml)(ml)1%1%致敏致敏SRBC(mlSRBC(ml)结果结果0.040.04 0.060.06 0.080.08 0.100.10 0.120.12 0.140.14
14、0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.160.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.160.1 0.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 混匀,混匀,3737水浴水浴30min30min0.2 0.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 混匀,混匀,3737水浴水浴30min30min不溶血不溶血 不溶血不溶血 微溶血微溶血 微不溶血微不溶血 全溶血全溶血 全溶血全溶血(二)血清标本采集血液标本后及时分离血清,及时检验或将血清保存于20。血清在试验前应先加热5630min(或603min)以破坏补
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