酶联免疫吸附试验-课件.ppt

1、 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 （Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)ELISAELISA的基本原理的基本原理使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），用洗涤的方法去除未结合的酶标抗

2、原（或抗体），最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析。据颜色反应的深浅来定性或定量分析。ELISA的类型的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，）固相的抗原或抗体，（2

3、）酶标记的抗原或抗体，）酶标记的抗原或抗体，（3）酶作用的底物。）酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。计出各种不同类型的检测方法。一、双抗体夹心法一、双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原抗原-酶标记抗体复合

4、物。酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。+固相抗体 标本 酶标抗体 底物 显色二、间接法测抗体二、间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法。操作步骤如下：间接法是检测抗体最常用的方法。操作步骤如下：1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体抗体-酶标记抗抗体酶标记抗抗体复合物。复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。+固相抗原 标本 酶标抗体 底物 显色三、酶标抗原竞争法三、酶标抗原竞争法 竞

5、争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。原的量呈反比。1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。3.同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原为

6、酶标记抗原-抗体复合物。抗体复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。YYY+YYY+YYY参参考考管管酶标抗原YYY+YYY+YYY待待测测管管酶标抗原抗原间接间接ELISA方法的建立方法的建立1、抗原最佳包被液的选择；、抗原最佳包被液的选择；2、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定；、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定；3、封闭液的选择；、封闭液的选择；4、封闭时间的优化；、封闭时间的优化；5、血清稀释液的选择；、血清稀释液的选择；6、抗原抗体反应时间的优化。、抗原抗体反应时间的优化。ELISA操作步骤操作步骤以间接以间接ELISA为例：为例：1、包被抗原、包被抗原:用包被液将抗原稀释

7、至合适浓度，加入到用包被液将抗原稀释至合适浓度，加入到酶标板中，每孔酶标板中，每孔100l，4过夜；过夜；2、洗涤、洗涤:弃去孔内液体，用洗涤液洗弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次次，每次 3min，最后用吸水纸拍干；最后用吸水纸拍干；3、封闭：各孔加入封闭液、封闭：各孔加入封闭液200ul，37作用作用1h；4、洗涤；、洗涤；5、加被检血清：将血清样品稀释至最佳浓度，每、加被检血清：将血清样品稀释至最佳浓度，每孔孔100L，每个样本两孔，每块板同时设阴性、阳，每个样本两孔，每块板同时设阴性、阳性及空白对照各两孔，性及空白对照各两孔，37作用作用30min；6、洗涤；、洗涤；7、酶标二抗：稀释

8、酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪标记羊抗猪IgG，每孔，每孔100L，37作用作用30min；8、洗涤；、洗涤；9、显色：加新鲜配制的、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔底物液每孔100L，室温，室温避光作用避光作用15min；10、加终止液：加、加终止液：加50L 2mol/L硫酸；硫酸；11、读数：用酶标仪检测、读数：用酶标仪检测OD450值。值。血清学方法有很多种血清学方法有很多种,如传统的琼脂扩散如传统的琼脂扩散(A G ID)、血血凝抑制凝抑制(H A/H I)、乳胶凝集、乳胶凝集、试管凝集、补体结合试管凝集、补体结合等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。等方法，但这些方法不是最合适

9、的检测方法。EILSA技技术与其有着不同的特点：术与其有着不同的特点：1、灵敏度高。、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号是通过酶促反应放大检测信号,从从而提高检测的灵敏度而提高检测的灵敏度,其检测限可达其检测限可达 ng 甚至甚至pg 水平水平,可可做定量测定。做定量测定。2、特异性强。、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程的每一步体的特异性识别过程,结结构类似物、构类似物、有色物质、有色物质、荧光物质等对检测的影响很小。荧光物质等对检测的影响很小。3、样品的预处理过程和、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷，的操作步骤简单快捷，有的试剂盒仅需有的试剂盒

10、仅需12个小时即可得出检测结果，并且可同个小时即可得出检测结果，并且可同时检测数十甚至上百个样品。时检测数十甚至上百个样品。4、设备简单，适用于基层。、设备简单，适用于基层。ELISA的优点：的优点：ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。ELISA的应用的应用