生物酶工程课件.ppt
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- 生物酶 工程 课件
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1、Contents一、生物酶工程的定义二、生物酶工程的内容三、生物酶工程的前景GoGoGo 生物酶工程生物酶工程是酶学和以基因重组技术是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产为主的现代分子生物学技术相结合的产物,亦称高级酶工程物,亦称高级酶工程(Advanced Enzyme(Advanced Enzyme Engineering)Engineering)。一、一、生物酶工程生物酶工程1.1.定义定义二、二、生物酶工程的内容生物酶工程的内容(3 3)从蛋白质或基因水平上设计,合成酶杂合从蛋白质或基因水平上设计,合成酶杂合体或自然界不曾有的酶(杂合酶)。体或自然界不曾有的酶(杂合酶
2、)。生物酶工程主要包括:生物酶工程主要包括:(1 1)用基因工程技术大量生产酶(克隆酶);用基因工程技术大量生产酶(克隆酶);(2 2)修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶);修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶);(4 4)抗体酶抗体酶;(5 5)核酶核酶。通过基因工程手段,克隆各种天然酶的基因,通过基因工程手段,克隆各种天然酶的基因,将其克隆到表达载体中,然后将表达载体转化到适将其克隆到表达载体中,然后将表达载体转化到适当的宿主中,得到表达特定酶的基因工程菌,通过当的宿主中,得到表达特定酶的基因工程菌,通过基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为克隆酶克隆酶。1.克隆酶克隆
3、酶(1 1)克隆酶的定义:)克隆酶的定义:克隆酶图例克隆酶图例基因工程菌基因工程菌载体载体宿主宿主生物体生物体发酵发酵克隆酶克隆酶酶基因酶基因 外源基因转入微生物宿主细胞内,与宿主外源基因转入微生物宿主细胞内,与宿主细胞的遗传物质相结合,后代宿主的遗传物质细胞的遗传物质相结合,后代宿主的遗传物质中含有外源基因,这种带上人工赋予的新的遗中含有外源基因,这种带上人工赋予的新的遗传特性的宿主微生物,被称为传特性的宿主微生物,被称为基因工程菌基因工程菌。2.2.基因工程菌的定义基因工程菌的定义(1 1)在宿主细胞内可以自主复制;在宿主细胞内可以自主复制;(2 2)克隆酶对载体的要求)克隆酶对载体的要求
4、(2 2)容易引入受体细胞;)容易引入受体细胞;(3 3)具有合适的筛选标记基因;具有合适的筛选标记基因;(4 4)具有少数限制性酶切位点。具有少数限制性酶切位点。(3 3)克隆酶对宿主的要求克隆酶对宿主的要求(1 1)安全可靠,非致病菌;)安全可靠,非致病菌;(3 3)有利于酶的分离和纯化;)有利于酶的分离和纯化;(5 5)容易培养和管理。)容易培养和管理。(4 4)能利用廉价的原料,发酵周期短,产量高;)能利用廉价的原料,发酵周期短,产量高;(2 2)外源基因在宿主内能够表达且不被分解;)外源基因在宿主内能够表达且不被分解;(4 4)克隆酶基因的表达系统克隆酶基因的表达系统o 原核生物的基
5、因表达系统原核生物的基因表达系统o 真核生物的基因表达系统真核生物的基因表达系统 1.1.酵母表达系统酵母表达系统 2.2.植物表达系统植物表达系统 3.3.动物表达系统动物表达系统 4.4.丝状真菌表达系统丝状真菌表达系统 纤维素酶基因工程菌的构建纤维素酶基因工程菌的构建(5 5)克隆酶实例克隆酶实例v 纤维素酶纤维素酶 纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行业具有广泛的用途。但由于天然纤维素酶产量业具有广泛的用途。但由于天然纤维素酶产量低、来源有限而导致其大规模应用受到限制。低、来源有限而导致其大规模应用受到限制。纤维素酶纤维素酶(cellulasecel
6、lulase)是能将纤维素水解)是能将纤维素水解为葡萄糖等简单糖类的一组酶的总称。为葡萄糖等简单糖类的一组酶的总称。|为此,通过基因工程技术,克隆福寿螺体内为此,通过基因工程技术,克隆福寿螺体内的纤维素酶基因,构建含有的纤维素酶基因,构建含有celcel的基因工程菌,的基因工程菌,以期通过液体培养或以期通过液体培养或固体培养固体培养的方式得到大量的的方式得到大量的克隆纤维素酶。克隆纤维素酶。afp基因转化受体转化受体低温筛选低温筛选l技术路线技术路线1 1A.bgpdL.egpdV.vgpd+表达表达载体载体PEGPEG介导转化介导转化农杆菌介导转化农杆菌介导转化电激转化电激转化分子鉴定分子鉴
7、定原生质体原生质体或菌丝球或菌丝球建立转化体系低温筛选体系建立l技术路线技术路线2 2CelCel基因工程基因工程菌株的筛选菌株的筛选液体液体发酵发酵分离纯化分离纯化 定义:利用有控制地对天然酶基因进行剪定义:利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变,从而改变这些酶的催化切、修饰或突变,从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或稳定性,使之更加符特性、底物专一性或稳定性,使之更加符合人们的需要。合人们的需要。2.2.突变酶突变酶 遗传修饰改变酶的性能大致有:遗传修饰改变酶的性能大致有:(1)提高酶的活性)提高酶的活性 (2)提高酶的稳定性)提高酶的稳定性(3)改变底物专一性)改变底物专一性 (
8、4)改变酶的最适)改变酶的最适pH值值(5)改变酶对辅酶的要求)改变酶对辅酶的要求(6)改变酶的别构调节能力)改变酶的别构调节能力修饰酶基因的方法主要方法修饰酶基因的方法主要方法 (i)定位突变)定位突变 (ii)体外定向进化)体外定向进化 定位突变(定位突变(site-directed mutagenesis)是根据是根据酶的结构、功能和作用机制的信息,在基因水平酶的结构、功能和作用机制的信息,在基因水平上精确改变酶分子中的氨基酸残基,上精确改变酶分子中的氨基酸残基,对酶的性质对酶的性质和其催化特性进行改造,产生符合特定需要的和其催化特性进行改造,产生符合特定需要的酶酶。(i i)定位突变)
9、定位突变l 盒式诱变盒式诱变l 寡聚苷酸引物诱变寡聚苷酸引物诱变l PCR诱变诱变 方法:方法:(1 1)盒式诱变)盒式诱变o 原理原理:利用一段人工合成的具有突变序列的寡聚核甘利用一段人工合成的具有突变序列的寡聚核甘酸片段(寡核甘酸盒,酸片段(寡核甘酸盒,Oligonucleotide Cassette),取),取代野生型基因中的相应序列。代野生型基因中的相应序列。HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI+(2 2)寡聚苷酸引物诱变)寡聚苷酸引物诱变o 原理原理:用化学合成的含有突变碱基的寡核甘酸短片段用化学合成的含有突变碱基的寡核甘酸短片段作为引物,启动单链作为引物,启动单链DNA
10、分子进行复制,生产出来的分子进行复制,生产出来的新链中目的基因的特定位点具有已经发生突变的碱基新链中目的基因的特定位点具有已经发生突变的碱基序列。序列。A转化GTAGAATCGCTTCTACTAGGCTAP标记筛选分离突变体(3 3)PCRPCR诱变诱变o 定点诱变法定点诱变法o 大引物诱变法大引物诱变法特点:可以在特点:可以在DNADNA区段的任何部位产生定点突变。区段的任何部位产生定点突变。o 原理原理:在头两轮的在头两轮的PCR反应中,应用两个互补的并在反应中,应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物,扩增形成两相同部位具有相同碱基突变的内侧引物,扩增形成两条有一端可彼此重叠
11、的双链条有一端可彼此重叠的双链DNA片段,两者在其重叠片段,两者在其重叠区段具有同样的突变。故此两条双链区段具有同样的突变。故此两条双链DNA片段经变性片段经变性和退火处理,形成两种不同形式的异源双链分子。然和退火处理,形成两种不同形式的异源双链分子。然后选用两个外测寡核甘酸引物进行第三轮后选用两个外测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增,扩增,可得到一种含有突变位点的突变体可得到一种含有突变位点的突变体DNA。5353靶DNA片段5533混合、变性、退火定定点点诱诱变变法法5353大引物大引物诱变法诱变法5533大引物大引物PCRPCRPCR多次循环PCR一理论来源一理论来源o 利用基因工程原理
12、可以在实验室中模拟生物进化过程利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 n 化学进化化学进化n 生物进化生物进化(iiii)体外定向进化)体外定向进化 人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化机制,在体外对基因进行随机突变,从一个或多机制,在体外对基因进行随机突变,从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的)个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的)出发,经过基因的突变和重组,构建一个人工突出发,经过基因的突变和重组,构建一个人工突变酶库,通过一定的筛选或选择方法最终获得预变酶库,通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶先
13、期望的具有某些特性的进化酶的分子进化技术的分子进化技术称为称为体外定向进化体外定向进化。体外定向进化体外定向进化定向进化示意图定向进化示意图细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力(温度)(温度)温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度为最适生长温度为37370 0C C最适生长温度提高了!最适生长温度提高了!随机突变随机突变+定向选择目标突变体定向选择目标突变体 Strategies for the development of effective enzymes定向进化定向进化n 属于蛋白质的非合理设计,它不需要事先了解酶属于蛋
14、白质的非合理设计,它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制,人为地创造特殊的进化的空间结构和催化机制,人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化机制(随机突变、基因重组条件,模拟自然进化机制(随机突变、基因重组和自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择和自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择(或筛选)出所需性质的突变酶。(或筛选)出所需性质的突变酶。定向进化随机突变选择定向进化随机突变选择澄清一个事实:定向进化澄清一个事实:定向进化不是不是定点突变定点突变o 定向进化:突变定向进化:突变 筛选筛选 突变位点是随机的,不确定的;突变位点是随机的,不确定的;突变位点的数目也是不确定的;突变位点的数目也
15、是不确定的;突变的效应更是不可预知的;突变的效应更是不可预知的;理论上讲,凡是能够引起突变的因素(物理的,化学的,理论上讲,凡是能够引起突变的因素(物理的,化学的,生物的)都可以应用于定向进化中突变体的产生。生物的)都可以应用于定向进化中突变体的产生。o 定点突变:定点突变:突变位点是确定的,突变的个数也是预知的;突变位点是确定的,突变的个数也是预知的;突变的效应可能是已知的,也可能是未知的;突变的效应可能是已知的,也可能是未知的;定点突变的方法一般是以定点突变的方法一般是以PCRPCR技术为基础的。技术为基础的。易错易错PCRPCR技术技术(error-prone PCR)(error-pr
16、one PCR)DNADNA改组改组(DNA shuflling)(DNA shuflling):由美国:由美国Stemmer Stemmer 于于1994 1994 年首次提出年首次提出 一项体外重组技术一项体外重组技术 随机引发重组随机引发重组(RPR)1998(RPR)1998 年年,Arnold,Arnold 提出了一提出了一种有效的新方法种有效的新方法 交错延伸技术交错延伸技术(StEP)(StEP):由:由Zhao Zhao 等等 提出提出,是一种是一种简化的简化的DNA shuffling DNA shuffling 技术技术 随机突变的策略随机突变的策略易错易错PCR易错易错P
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