高分子药物载体课件.ppt
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- 高分子 药物 载体 课件
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1、 张张 琰琰华东理工大学材料科学与工程学院华东理工大学材料科学与工程学院 RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默转录后基因沉默现象.它是一种跨越多种种属的古老的生物途径,同时它的出现为生物学家提供了一种快速、简便的反向遗传学技术,在后基因组时代功能基因的研究中具有重要的应用前景.2.2.基因治疗基因治疗lRNA干扰的核心内容是siRNA(RNA(small interfering RNA),它利用了由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象,其本质是siRNA与对应
2、的mRNA特异结合、降解,从而阻止mRNA的翻译。lRNAi是生物进化的结果,是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物,具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达RNA的生物学功能。RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,而且有可能在基因功能测定,基因治疗等方面开辟一条新思路。2.2.基因治疗基因治疗(一)(一)RNAiRNAi的发现的发现l1990 年,为加深矮牵牛花(petunias)的紫色,Jorgensen 等导入了一个强启动子控制的色素基因。结果许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制
3、了,Jorgensen 把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。P35S色素基因色素基因Ti质粒质粒色素色素基因基因重组重组转化转化繁殖繁殖美国科学家安德鲁美国科学家安德鲁-费里和克拉格费里和克拉格-米洛因为发现了米洛因为发现了RNARNA干扰现象而获得了干扰现象而获得了20062006年度诺贝尔医学奖年度诺贝尔医学奖 l1998 年,Andrew Fire 等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的研究证明,在正义RNA 阻断基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)。他们将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,
4、并证实这种抑制主要作用于转录之后,所以又称RNAi 为转录后基因沉默(postt ranscriptional gene silencing,PTGS)l1999 年,Hamilton 等在植物基因沉默的研究中首次发现,2125nt 的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。lHammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验,证明了这些小分子双链RNA(siRNA)在RNAi 中的作用。l随后人们陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsis
5、thaliana)、大小鼠和人体内发现了RNAi 现象。RNAiRNAi 技术的应用技术的应用1.基因功能研究:利用RNAi技术使目的基因沉默,研究基因的功能。如利用RNAi技术证明ag-1基因与拟南芥花的发育有关。Chiou-Fen Chuang and Elliot M.Meyerowitz*PNAS April 25,2000 vol.97 No.9 49854990RNAiRNAi 技术的应用技术的应用2.临床应用:RNAi 机制可作为真核生物的基因组免疫系统,抑制外源和内源有害基因的表达。利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会抑制病毒的增殖,这为病毒相关
6、疾病的治疗提供了新的思路。利用RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。3.3.基基因的传递系统因的传递系统一个理想的基因传递系统应具备以下重要的一个理想的基因传递系统应具备以下重要的性质性质 :携带性能携带性能 安全性安全性缓释作用缓释作用能携带足够数量的目的基因能携带足够数量的目的基因对机体没有毒性对机体没有毒性 、致病性或免疫原性、致病性或免疫原性 ,具有生物降解性或良好的生物相容性具有生物降解性或良好的生物相容性控制基因的释放控制基因的释放,延长基因的表达时间延长基因的表达时间,改善基因治疗的效果改善基因治疗的效果理想的基因传递系统理想的基因传递系统稳定性稳定
7、性载体系统本身应稳定载体系统本身应稳定 ,而且要保护携带的基因免受核酸酶等的破坏而且要保护携带的基因免受核酸酶等的破坏 靶向性能靶向性能 可有效地将目的基因输可有效地将目的基因输送至靶细胞内送至靶细胞内 理想的基因传递系统理想的基因传递系统可促进目的基因从内吞小泡释放进入胞浆可促进目的基因从内吞小泡释放进入胞浆 ;可促进目的基因转运可促进目的基因转运入核入核;可调控基因输入后在体内的表达可调控基因输入后在体内的表达,因为表达失控的后果将因为表达失控的后果将是非常严重的。是非常严重的。传递系统传递系统l在已进行的基因传递系统的临床研究中在已进行的基因传递系统的临床研究中 ,反转录病毒传反转录病毒
8、传递系统递系统占首位占首位 ,共计共计 150150多个治疗方案多个治疗方案 ,病例数达病例数达 1200 1200 多人多人 ;l脂质体传递系统脂质体传递系统位于第二位于第二,治疗方案治疗方案 70 70 多个多个 ,病病 例数例数达达 700 700 多人多人 ;l腺病毒传递系统腺病毒传递系统位于第三位于第三,治疗方案约治疗方案约 70 70 个个,病例数达病例数达 400 400 多人多人 ;l排在后面的基因传递系统依次是产生反转录病毒的包排在后面的基因传递系统依次是产生反转录病毒的包装细胞装细胞 、Pox Pox 病毒、病毒、DNA DNA 载体和腺相关病毒。载体和腺相关病毒。(一一)
9、病毒基因传递系统病毒基因传递系统 l病毒基因传递系统也称病毒载体病毒基因传递系统也称病毒载体 (viral vector),(viral vector),是野生型是野生型病毒经改造除去致病性后得到的基因输送系统病毒经改造除去致病性后得到的基因输送系统其主要特点是其主要特点是转染相对高效转染相对高效 ,但安全性较差但安全性较差。基因治疗关键步骤之一,是将治疗基因高效转移入患者体内、基因治疗关键步骤之一,是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。并能调控其适度表达。常用的载体有两类:常用的载体有两类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体和非病毒载体。病毒载体:病毒载体:逆转录病毒载体,逆转录病
10、毒载体,腺病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体等;腺相关病毒载体等;非病毒载体:非病毒载体:与病毒载体的主要区别在于:采用理化方法将治疗基因与病毒载体的主要区别在于:采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。转移入患者体内。基因载体的选择基因载体的选择 治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒DNADNA直接转移法直接转移法基因转移方法基因转移方法 磷酸钙法磷酸钙法 DEAEDEAE葡聚糖法葡聚糖法 电穿孔法电穿孔法 粒子轰击法(基因枪法)粒子轰击法(基因枪法)(二二)非病毒基因传递系统非病毒基因传递系统 非
11、病毒基因传递系统也称非病毒载体非病毒基因传递系统也称非病毒载体 (non-viral vector),(non-viral vector),可可以克服病毒载体的很多缺陷以克服病毒载体的很多缺陷,己越来越引起科学家的重视。己越来越引起科学家的重视。目前已进入临床研究的主要是目前已进入临床研究的主要是阳离子脂质体阳离子脂质体和和DNA DNA 载体载体。非病毒基因传递系统的非病毒基因传递系统的主要特点主要特点是安全性好是安全性好,但转染相对但转染相对低效。低效。非病毒载体系统实际上是将需要导入的外源基因视为药物,将其运送到特定的细胞或组织器官。(1)DNA 载体载体lDNA DNA 载体又称载体又
12、称质粒质粒 DNA DNA(plasmid DNA)(plasmid DNA)或裸或裸 DNA DNA(naked DNA),(naked DNA),可能是最简单的非病毒传递系统。可能是最简单的非病毒传递系统。l用于基因治疗的质粒用于基因治疗的质粒 DNA DNA 产品与一般的药品很类似产品与一般的药品很类似 ,需要有一定的剂型和质量标准。需要有一定的剂型和质量标准。l纯化质粒纯化质粒 DNA DNA 的安全性较好的安全性较好 ,不会引起炎症反应等不会引起炎症反应等 ,适用面也较广适用面也较广 ,剂量可以因人而异。剂量可以因人而异。DNA 载体载体l 裸DNA(naked DNA)未经包装的质
13、粒载体,是结构最简单的非病毒载体。由于在体内易被降解破坏(缺乏保护性外包装)又无靶向性(缺乏可被靶细胞识别的成分),故多采用直接注射或基因枪等物理方法直接导入靶组织或靶器官,如皮肤、骨骼肌、心肌或肿瘤等。l 利用本法将编码抗原的基因导入皮下,可激发机体产生相应的免疫反应,被称为DNA疫苗(DNA vaccine),是一种较有前途的免疫方法。DNA 载体载体l质粒质粒 DNA DNA 在靶细胞中的表达效率较低在靶细胞中的表达效率较低 ,持续时间较短持续时间较短,因此需要的剂量比较大。因此需要的剂量比较大。l一般在一个疗程的治疗中需要毫克数量级的质粒一般在一个疗程的治疗中需要毫克数量级的质粒 DN
14、A DNA l如何进行质粒如何进行质粒 DNA DNA 的大规模生产的大规模生产 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后,可以自动形成包埋外源混合后,可以自动形成包埋外源DNADNA的脂的脂质体,然后与细胞一起孵育,即可通过细质体,然后与细胞一起孵育,即可通过细胞内吞作用将外源胞内吞作用将外源DNADNA(即目的基因)转(即目的基因)转移至细胞内,并进行表达。移至细胞内,并进行表达。(2)(2)脂质体载体脂质体载体(2)(2)脂质体载体脂质体载体 用脂质体作为载体进
15、行基因输送的研究已有用脂质体作为载体进行基因输送的研究已有 20 20 多年多年 ,这是因为脂质体可促进大分子物质对细胞这是因为脂质体可促进大分子物质对细胞膜的穿透膜的穿透。阳离子脂质体阳离子脂质体阴离子脂质体阴离子脂质体 pH pH 敏感型脂质体敏感型脂质体 融合脂质体融合脂质体 脂质体介导的基因转移示意图(a)阳离子脂质体阳离子脂质体l阳离子脂质体阳离子脂质体 (cationic liposomes(cationic liposomes)是基因治疗中应是基因治疗中应用最多的非病毒传递系统用最多的非病毒传递系统 l一般由带正电荷的脂类与中性脂类按一定的摩尔一般由带正电荷的脂类与中性脂类按一定
16、的摩尔比组成。比组成。(a)阳离子脂阳离子脂质体质体用于制备阳离子脂质体的阳离子脂类大多是合成的用于制备阳离子脂质体的阳离子脂类大多是合成的双链季铵盐型两性分子双链季铵盐型两性分子 主要作用就是提供正电荷,增加与主要作用就是提供正电荷,增加与 DNA DNA 的缩合的缩合 一般化学稳定性较好一般化学稳定性较好,可以生物降解可以生物降解,但均有一定的但均有一定的细细胞毒性胞毒性。(b)中性脂中性脂质体质体l中性脂类的作用是稳定脂质双层膜、降低阳离子脂质的中性脂类的作用是稳定脂质双层膜、降低阳离子脂质的毒性、特别是促进脂质体对细胞的渗透。毒性、特别是促进脂质体对细胞的渗透。胆固醇胆固醇 (Chol
17、(Chol)磷磷酯酰酯酰胆碱胆碱 (PC)(PC)磷磷酯酰酯酰乙醇乙醇胺胺 (PE)(PE)二油酰基磷脂酰胆碱二油酰基磷脂酰胆碱 (DOPC)(DOPC)二油酰基磷脂酰乙醇二油酰基磷脂酰乙醇胺胺 (DOPE)(DOPE)阳离子脂质体的转染效率影响因素阳离子脂质体的转染效率影响因素1.1.粒径粒径 内吞小泡的大小约在内吞小泡的大小约在 8080200 n m 200 n m 之间之间,因此内吞作用是一因此内吞作用是一个体积限制性步骤个体积限制性步骤,这就要求所制备的阳离子脂质体大小这就要求所制备的阳离子脂质体大小适宜适宜 ,而且复合物也应足够小而且复合物也应足够小,或者说缩合应比较完全或者说缩合
18、应比较完全;由由于复合物的形成是一个自发的过程于复合物的形成是一个自发的过程,控制起来有一定控制起来有一定难度难度,而且复合物还可能进一步聚集而且复合物还可能进一步聚集,因此一般是将脂因此一般是将脂质体质体 和和 DNA DNA 分别包装分别包装,临用时再进行混合临用时再进行混合 。1.1.粒径粒径 阳离子脂质体在血阳离子脂质体在血液循环液循环中的稳定性是一个重要的问题中的稳定性是一个重要的问题,阳离子脂质体在血阳离子脂质体在血液循环液循环中会带上负电荷中会带上负电荷,而且容易发生而且容易发生聚集或破裂聚集或破裂,释放出释放出 DNADNA。用用聚乙二醇等进行修饰聚乙二醇等进行修饰可在可在一定
19、程度上降低复合物与血液成份的相互作用。一定程度上降低复合物与血液成份的相互作用。2.2.稳定性稳定性1.1.具有多个正电荷头部的脂质体转染效率高具有多个正电荷头部的脂质体转染效率高,可能是与可能是与 DNA DNA 作用更牢、缩合较好有关作用更牢、缩合较好有关;2.2.二油二油酰酰基磷脂基磷脂酰酰乙醇乙醇胺胺(DOPEDOPE)具有很强的细胞膜具有很强的细胞膜去稳定化作用去稳定化作用,可以提高可以提高 DNA DNA 的转染效率的转染效率,随着随着 DOPE DOPE 比例增加比例增加,转染效率随之提高转染效率随之提高,但脂质体在血中的稳定但脂质体在血中的稳定性也会下降。性也会下降。(c)(c
20、)阴离子脂质体阴离子脂质体l阴离子脂质体阴离子脂质体 (anionic liposomes(anionic liposomes)所用的阴离子脂所用的阴离子脂质包括磷质包括磷酯酰酯酰丝氨酸、心肌磷脂和二棕榈磷脂酰丝氨酸、心肌磷脂和二棕榈磷脂酰甘油等。由于载体与甘油等。由于载体与 DNA DNA 都带负电都带负电,为了为了提高包提高包封效率常需在制备脂质体时加入钙封效率常需在制备脂质体时加入钙。l阴离子脂质体的特点是可将低聚核苷酸定位于细阴离子脂质体的特点是可将低聚核苷酸定位于细胞核胞核,而且可延长低聚核苷酸在细胞内的保留时而且可延长低聚核苷酸在细胞内的保留时间。间。l对阴离子脂质体的研究还比较少
21、。对阴离子脂质体的研究还比较少。(d)pH(d)pH 敏感型脂质体敏感型脂质体 PHPH敏感脂质体敏感脂质体(pH-sensitive pH-sensitive liposomesliposomes)是一种具有细胞内是一种具有细胞内靶向和控制药物靶向和控制药物(如基因、肽、蛋白质如基因、肽、蛋白质)释放的功能性脂释放的功能性脂质体。质体。pH pH 敏感型脂质体敏感型脂质体膜融合机制膜融合机制1.1.在酸性条件下,即在核内体形成后几分钟内,进入溶酶在酸性条件下,即在核内体形成后几分钟内,进入溶酶体之前,体之前,pHpH从从7.47.4减至减至5.35.36.36.3左右时,可导致脂肪酯羧左右时
22、,可导致脂肪酯羧基的质子化,而引起六角晶相的形成,基的质子化,而引起六角晶相的形成,2.pH2.pH敏感脂质体膜发生结构改变,促使脂质体膜与核内体敏感脂质体膜发生结构改变,促使脂质体膜与核内体/溶酶体膜的融合,溶酶体膜的融合,3.3.将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织,避免网状将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织,避免网状内皮系统的清除。内皮系统的清除。(e)融合脂质体融合脂质体融合脂质体融合脂质体 是在制备脂质体时加入融合剂而获得。是在制备脂质体时加入融合剂而获得。常用融合剂包括常用融合剂包括 PEG PEG、甘甘油油 、PVA PVA、以及重组病毒的细以及重组病毒的细胞膜或某些病毒蛋
23、白胞膜或某些病毒蛋白。DOPE DOPE 也具有融合剂的性质也具有融合剂的性质,主要用于阳离子脂质体主要用于阳离子脂质体 /DNA/DNA 复合物的制备复合物的制备 。目前应用还比较少。目前应用还比较少。3.3.阳离子聚合物阳离子聚合物 阳离子聚合物阳离子聚合物 (cationic polymer)(cationic polymer)与与 DNA DNA 可以在电荷作可以在电荷作用下发生缩合用下发生缩合,形成稳定的复合物形成稳定的复合物,防止防止 DNA DNA 的降解的降解,其大小可在其大小可在 100 n m 100 n m 以下以下,表面带正电表面带正电,有利于与靶细胞有利于与靶细胞的的
24、 吸附。吸附。这类载体的安全性较好这类载体的安全性较好 ,容易制备容易制备 ,不足之处不足之处是缺乏靶向性是缺乏靶向性,而且单独应用时转染效率比较低。而且单独应用时转染效率比较低。3.3.阳离子聚合物阳离子聚合物l可选择的阳离子聚合物可选择的阳离子聚合物 聚氨基化合物聚氨基酸星状树突体阳离子聚合物阳离子聚合物基因载体基因载体聚乙烯亚聚乙烯亚胺胺(PEI)lPEI是一种比较常用的阳离子聚合物是一种比较常用的阳离子聚合物l具有高度分枝的结构具有高度分枝的结构,l内部的氨基与末端的氨基可在不同的内部的氨基与末端的氨基可在不同的 pH 下离子化下离子化,l有较强的缓冲性能有较强的缓冲性能PEIPEI有
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