酶类药物的分析-课件.ppt

1、1酶类药物的分析酶类药物的分析第一节第一节 概述概述第二节第二节 酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查第三节第三节 酶活力测定方法酶活力测定方法第四节第四节 酶活力测定方法设计酶活力测定方法设计第五节第五节 典型酶类药物的检测典型酶类药物的检测1PPT课件2。品种来源剂型类别门冬酰胺酶（埃希）大肠埃希菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（埃希）门冬酰胺酶（埃希）冻干粉剂抗肿瘤药门冬酰胺酶（欧文）欧文菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（欧文）门冬酰胺酶（欧文）冻干粉剂抗肿瘤药抑肽酶牛胰、牛肺提取粉剂蛋白酶抑制剂注射用抑肽酶抑肽酶冻干粉剂蛋白酶抑制剂尿激酶新鲜人尿提取粉剂溶栓药注射用尿激酶尿激酶

2、冻干粉剂溶栓药细胞色素C溶液猪心、牛心提取溶液细胞代谢改善药细胞色素C注射剂细胞色素C注射剂细胞代谢改善药注射用细胞色素C细胞色素C冻干粉剂细胞代谢改善药玻璃酸酶哺乳动物睾丸提取粉剂黏多糖分解酶注射用玻璃酸酶玻璃酸酶冻干粉剂黏多糖分解酶胃蛋白酶猪、羊或牛的胃黏膜提取粉剂助消化药胃蛋白酶片胃蛋白酶片剂助消化药胃蛋白酶颗粒胃蛋白酶颗粒剂助消化药含糖胃蛋白酶胃蛋白酶粉剂助消化药胰蛋白酶猪、羊或牛胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用胰蛋白酶胰蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶胰酶猪、羊或牛胰中提取的酶混合物粉剂助消化药胰酶肠溶片胰酶片剂助消化药胰酶肠溶胶囊胰酶胶囊剂助消化药胰激肽原酶猪胰中提取粉剂血管舒张药凝血酶冻干粉

3、牛血或猪血中提取的凝血酶原冻干粉剂局部止血药糜蛋白酶牛或猪胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用糜蛋白酶糜蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶2PPT课件3第一节第一节 概述概述n在生物体内，降低反应在生物体内，降低反应活化能活化能，加快可逆反应的进，加快可逆反应的进行速度。行速度。n一、酶的特性一、酶的特性n二、酶的分类二、酶的分类n三、酶的化学组成三、酶的化学组成n四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制n五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学3PPT课件4一、酶的特性一、酶的特性 1酶是高效催化剂。酶是高效催化剂。n2酶对底物的结构具有严格的选择性。酶对底物的结构具有严格的选择性。n（1）相对专一性：）相对

4、专一性：脂肪水解酶，蛋白水解酶脂肪水解酶，蛋白水解酶n（2）绝对专一性）绝对专一性:脲酶脲酶n（3）立体异构专一性）立体异构专一性:L-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶n3酶催化反应的反应条件温和。酶催化反应的反应条件温和。n4酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。4PPT课件5。5PPT课件6二、酶的分类二、酶的分类n氧化还原酶氧化还原酶n转移酶转移酶n水解酶水解酶n裂合酶裂合酶n异构酶异构酶n合成酶（或称连接酶）合成酶（或称连接酶）6PPT课件7三、酶的化学组成三、酶的化学组成 n分为分为简单酶和结合酶简单酶和结合酶两大类。两大类。n结合酶类中除含有蛋白外，

5、还含有某种热稳定结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称为为“全酶全酶”，才呈现生物催化活性。，才呈现生物催化活性。n结合酶结合酶 =酶蛋白酶蛋白+辅助因子辅助因子7PPT课件8四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制 n1酶酶-底物复合物的形成底物复合物的形成 在酶促反应中，反应在酶促反应中，反应底物首先与酶分子上活性部位结合，形成底物首先与酶分子上活性部位结合，形成酶酶-底底物复合物物复合物，降低反应的，降低反应的活性能活性能，使酶促反应顺，使酶促反应顺利进行。利进行。n2酶酶-底物复合物加速反应速率的原因底物

6、复合物加速反应速率的原因n（1）定向作用与底物浓缩）定向作用与底物浓缩 n（2）酶使底物分子变形）酶使底物分子变形 n（3）酸碱催化）酸碱催化n（4）共价催化）共价催化。8PPT课件9五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学 n酶的活力单位酶的活力单位 酶活性单位（酶活性单位（U）是酶活性）是酶活性高低的一种量度，用高低的一种量度，用U/g或或U/ml表示。表示。n酶活力单位定义：在规定的条件下，每分酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化钟能转化1mol底物所需要的酶量，称一底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位。个酶的活力单位。n酶的比活力酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力，每毫克酶蛋白

7、所含酶活力，U/mg。9PPT课件10Michaelis-MentenMichaelis-Menten快速平衡学说快速平衡学说n底物浓度的增加，反应底物浓度的增加，反应速度上升呈速度上升呈双曲线双曲线。n在在低底物浓度低底物浓度时，反应时，反应速度呈直线上升，表现速度呈直线上升，表现为为一级反应一级反应。n在高浓度时，反应速度在高浓度时，反应速度达到一个极限值，呈现达到一个极限值，呈现零级反应零级反应。10PPT课件11米氏方程米氏方程n酶反应动力学方程式：酶反应动力学方程式：nV反应初速度反应初速度nVm最大反应速度最大反应速度nKs 米氏常数，米氏常数，Ks=K1/K1，Ks为为ES的解离

8、常数，的解离常数，表示酶与底物的亲和力表示酶与底物的亲和力。nKs为反应速度为反应速度V是最大反应速度是最大反应速度Vm一半时所需底物浓一半时所需底物浓度，即度，即V=1/2 Vm时，时，Ks=S。11PPT课件12Briggs-Haldane稳态学说稳态学说 nES的形成速度与的形成速度与ES的解离速度相等，达到的解离速度相等，达到动态平动态平衡衡，即，即“稳态稳态”，反应方程式：，反应方程式：nKm取代了取代了Ks，当当V=1/2 Vm时，时，Km=S。nKm也表示为底物与酶的亲和力。也表示为底物与酶的亲和力。12PPT课件132015版药典收载的酶原料版药典收载的酶原料n胰酶，胃蛋白酶胰

9、酶，胃蛋白酶n胰蛋白酶，糜蛋白酶，玻璃酸酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，玻璃酸酶n尿激酶尿激酶n抑肽酶，门冬酰胺酶抑肽酶，门冬酰胺酶13PPT课件品种来源剂型类别门冬酰胺酶（埃希）大肠埃希菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（埃希）门冬酰胺酶（埃希）冻干粉剂抗肿瘤药门冬酰胺酶（欧文）欧文菌提取粉剂抗肿瘤药注射用门冬酰胺酶（欧文）门冬酰胺酶（欧文）冻干粉剂抗肿瘤药抑肽酶牛胰、牛肺提取粉剂蛋白酶抑制剂注射用抑肽酶抑肽酶冻干粉剂蛋白酶抑制剂尿激酶新鲜人尿提取粉剂溶栓药注射用尿激酶尿激酶冻干粉剂溶栓药细胞色素C溶液猪心、牛心提取溶液细胞代谢改善药细胞色素C注射剂细胞色素C注射剂细胞代谢改善药注射用细胞色素C细胞色

10、素C冻干粉剂细胞代谢改善药玻璃酸酶哺乳动物睾丸提取粉剂黏多糖分解酶注射用玻璃酸酶玻璃酸酶冻干粉剂黏多糖分解酶胃蛋白酶猪、羊或牛的胃黏膜提取粉剂助消化药胃蛋白酶片胃蛋白酶片剂助消化药胃蛋白酶颗粒胃蛋白酶颗粒剂助消化药含糖胃蛋白酶胃蛋白酶粉剂助消化药胰蛋白酶猪、羊或牛胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用胰蛋白酶胰蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶胰酶猪、羊或牛胰中提取的酶混合物粉剂助消化药胰酶肠溶片胰酶片剂助消化药胰酶肠溶胶囊胰酶胶囊剂助消化药胰激肽原酶猪胰中提取粉剂血管舒张药凝血酶冻干粉牛血或猪血中提取的凝血酶原冻干粉剂局部止血药糜蛋白酶牛或猪胰中提取粉剂蛋白分解酶注射用糜蛋白酶糜蛋白酶冻干粉剂蛋白分解酶中国药典

11、中国药典收载的酶类药品品种收载的酶类药品品种14PPT课件15第二节第二节 酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查n鉴别方法鉴别方法:n蛋白质鉴别方法蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的双缩脲反，如在碱性条件下的双缩脲反应。应。nSDS-PAGESDS-PAGE电泳：降纤酶电泳：降纤酶nHPLCHPLC：门冬酰胺酶：门冬酰胺酶n专用于酶的鉴别方法：专用于酶的鉴别方法：n 酶活性试验：与特异性底物反应（酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶胰蛋白酶）。）。n 沉淀试验沉淀试验：胃蛋白酶胃蛋白酶n 动物试验：动物试验：透明质酸酶透明质酸酶水解粘多糖。水解粘多糖。15PPT课件16酶类药物的检查酶类药

12、物的检查 n酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在生产过程中可能带入微量的生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其脂肪类物质、其他的酶类和大分子杂质他的酶类和大分子杂质，影响酶质量，需有，影响酶质量，需有含量限度。含量限度。16PPT课件17酶类药物的检查酶类药物的检查n（一）脂肪含量限度检查一）脂肪含量限度检查n检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪不得过规定的含量。不得过规定的含量。n（二）其他酶类含量限度检查（二）其他酶类含量限度检查n胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏

13、中提取的蛋白分解酶。取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶时又易带入微提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶量的糜蛋白酶。n（三）大分子活性物质含量限度检查（三）大分子活性物质含量限度检查17PPT课件18胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每每2500U胰蛋白酶中不得多于胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。的糜蛋白酶。n糜蛋白酶专属水解糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸芳香氨基酸（L-酪氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸）苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。n用用N-乙酰乙酰-L-酪氨酸乙酯酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester

14、，ATEE）作底物，通过）作底物，通过分光光度法测定此分光光度法测定此酶对底物的水解速率酶对底物的水解速率来检查来检查该酶的含量限度。该酶的含量限度。18PPT课件19第三节第三节 酶活力测定方法酶活力测定方法n固定时间法固定时间法 n连续监测法连续监测法 n固定浓度法固定浓度法 19PPT课件20一、固定时间法一、固定时间法（终点法）（终点法）n在适宜的条件下，使酶和底物共同保温在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定一定时间时间，测定，测定产物生成的量产物生成的量或或底物消耗的量，底物消耗的量，计算出酶的含量（或活力）。计算出酶的含量（或活力）。n nE表示酶浓度，表示酶浓度，P为反应产物浓

15、度，为反应产物浓度，t 表表示酶作用时间，示酶作用时间，K为常数。为常数。20PPT课件21实例：n（1）胰胰弹性蛋白酶弹性蛋白酶活力单位定义：在活力单位定义：在pH 8.8，37条件下作用条件下作用20min，水解，水解1.0mg刚果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位。刚果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位。n n（2）天冬氨酸酶天冬氨酸酶活力活力单位定义：在测定条件单位定义：在测定条件下，每小时每克细胞转化生成下，每小时每克细胞转化生成1mol天冬氨天冬氨酸所需的酶量酸所需的酶量。21PPT课件22注意事项注意事项n缺点：无法了解整个反应缺点：无法了解整个反应过程是否都是零级反应。过程是否

16、都是零级反应。n注意事项：注意事项：n1、底物饱和、底物饱和n2、时间、时间22PPT课件23二、连续监测法（反应速度法）二、连续监测法（反应速度法）n在酶反应过程中，在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量或产物生成量。n酶底物大多是人工合成的酶底物大多是人工合成的“色素元色素元”，其本身无色，其本身无色，经经酶作用后释放出有色的反应产物酶作用后释放出有色的反应产物。根据反应过程。根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。中吸收度增高速率，算出酶活力单位。n测定时间测定时间.n例如：例如：n磷酸对硝基苯酚酯磷酸对硝基苯酚酯 对硝基苯酚对硝基苯酚

17、n法法23PPT课件下文为中国药典下文为中国药典2012015 5版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？n 供试品的制备：精密称取本品适量，用盐酸（供试品的制备：精密称取本品适量，用盐酸（0.001mol/L0.001mol/L）制成每）制成每1ml1ml中中含含50506060胰蛋白酶单位的溶液。胰蛋白酶单位的溶液。n底物溶液的制备：取底物溶液的制备

18、：取N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯盐酸盐精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg85.7mg，加水溶解使成，加水溶解使成100ml100ml，作为底物原液；底物溶液应在制成后，作为底物原液；底物溶液应在制成后2 2小时内使用。小时内使用。n测定法：取底物溶液测定法：取底物溶液3.0ml3.0ml，加盐酸溶液（，加盐酸溶液（0.001ml/L0.001ml/L）0.2ml0.2ml，混匀，作为，混匀，作为空白，取供试品溶液空白，取供试品溶液0.2ml0.2ml加底物溶液（预热至加底物溶液（预热至25250.50.5）3.0ml3.0ml，立即计，立即计时并摇匀，使比色池内温度保持在时并摇匀，使比色

19、池内温度保持在25250.50.5，照紫外可见分光光度法在，照紫外可见分光光度法在253nm253nm的波长处，每隔的波长处，每隔3030秒种读取吸收度，共秒种读取吸收度，共5 5分钟。每分钟。每3030秒钟吸收度的变秒钟吸收度的变化率应恒定在化率应恒定在0.0150.0150.0180.018之间，呈线性关系的时间不得少于之间，呈线性关系的时间不得少于3 3分钟。若不分钟。若不符合上述要求，应调整供试品的溶液浓度，另行测定。以吸收度为纵坐标，符合上述要求，应调整供试品的溶液浓度，另行测定。以吸收度为纵坐标，时间为横坐标做图，取在时间为横坐标做图，取在3 3分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算

20、。分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。n式中式中 P P为每为每1mg1mg供试样品中胰蛋白酶的单位数；供试样品中胰蛋白酶的单位数；nA A1 1为直线上终止的吸收度；为直线上终止的吸收度；A A2 2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；nT T为为A A1 1至至A A2 2读数的时间（分）；读数的时间（分）；W W为测定液中供试品的量；为测定液中供试品的量；n0.0030.003为上述条件下，吸收度每分钟改变为上述条件下，吸收度每分钟改变0.0030.003相当于一个胰蛋白酶单位。相当于一个胰蛋白酶单位。24PPT课件25三、固定浓度法三、固定浓度法 （fixed-concent

21、ration essay）n根据酶催化反应，使根据酶催化反应，使反应产物反应产物达到额定的浓达到额定的浓度时其度时其反应时间与酶浓度成反比反应时间与酶浓度成反比的原理进行的原理进行设计的。设计的。n P=KEtn以所需时间的倒数（以所需时间的倒数（1/t）对酶浓度作图即）对酶浓度作图即可制备标准曲线。可制备标准曲线。n优点：优点：1、记录时间。、记录时间。2、准确、准确25PPT课件26第四节第四节 酶活性测定方法的设计酶活性测定方法的设计 n一、影响因素一、影响因素 n二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法 n三、测定条件的选择三、测定条件的选择 26PPT课件27一、影响因素一、

22、影响因素 n1、底物底物n2、pHn3、温度温度n4、酶浓度酶浓度n5、空白和对照空白和对照27PPT课件28底物底物n酶可以同时作用多个底物。酶可以同时作用多个底物。n以以Km最小者最小者作为此酶的生理底物。作为此酶的生理底物。n从从底物性质底物性质看，选用的底物最好在物理化学性质看，选用的底物最好在物理化学性质上与产物不同，利于测定。上与产物不同，利于测定。n从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反应系统应使用足够高的应系统应使用足够高的底物浓度底物浓度。28PPT课件29胰凝乳蛋白酶几种底物的胰凝乳蛋白酶几种底物的Km底物底物Km（mmol/L

23、）N苯甲酰苯甲酰酪氨酰胺酪氨酰胺2.5N甲酰甲酰酪氨酰胺酪氨酰胺12.0N乙酰乙酰酪氨酰胺酪氨酰胺32.0甘氨酰甘氨酰酪氨酰胺酪氨酰胺122.029PPT课件30底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响S/KmV/Vmax0.010.990.11.015010911009930PPT课件31pHn酶活力测定选用酶活力测定选用缓冲体系缓冲体系。n不同缓冲液所受影响不同。不同缓冲液所受影响不同。磷酸盐磷酸盐所受影响较所受影响较小，而小，而Tris则受影响较大。则受影响较大。n酶溶液用量与底物溶液比例不超过酶溶液用量与底物溶液比例不超过10为宜。为宜。31PPT课件32温度温度n温度变化

24、温度变化1，反应速度可能相差，反应速度可能相差10以上以上，控制在控制在 0.1。n反应温度一般为反应温度一般为25，此时酶不易灭活，此时酶不易灭活，Km较小，可以使用较低的底物浓度。较小，可以使用较低的底物浓度。n有些酶在有些酶在37 不稳定。不稳定。32PPT课件33酶浓度酶浓度n酶样要充分稀释酶样要充分稀释。n取取3个不同酶量测得的个不同酶量测得的产物量产物量和和酶浓度酶浓度之间为正比关系，这之间为正比关系，这样的酶浓度范围就是适当的。样的酶浓度范围就是适当的。33PPT课件34空白和对照空白和对照n空白：指杂质反应或自发反应引起的变空白：指杂质反应或自发反应引起的变化量，代表未知因素的

25、影响。化量，代表未知因素的影响。n分为分为完全空白完全空白（如测定时要终止反应，（如测定时要终止反应，则空白可先加终止反应试剂再加酶）。则空白可先加终止反应试剂再加酶）。n酶空白酶空白n底物空白底物空白34PPT课件35二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法（酶反应的检（酶反应的检测方法）测方法）1、化学方法化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。n2、分光光度法分光光度法：常用的有常用的有比色法比色法和和紫外分光光度法紫外分光光度法。n3、荧光测定法：荧光测定法：简单、灵敏、快速。简单、灵敏、快速。n4、电化学分析法电化学分析法n

26、（1）离子选择性电极分析法离子选择性电极分析法n（2）微电流法微电流法n5、其他方法其他方法n如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。35PPT课件 酶活力测定反应的检测方法酶活力测定反应的检测方法按照酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中按照酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物

27、或量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物或产物选择具体的检测方法，包括容量分析法、气体检测产物选择具体的检测方法，包括容量分析法、气体检测法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等。法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等。分光光度法分光光度法 若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测定该酶促反应系统的光吸收度的变化量，推算出酶的活定该酶促反应系统的光吸收度的变化量，推算出酶的活力。多数酶类药物的含量检测（效价测定）均采用分光力。多数酶类药物的含量检测（效价

28、测定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、门冬酰胺酶、溶菌酶光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、门冬酰胺酶、溶菌酶等。等。36PPT课件37三、测定条件的选择三、测定条件的选择 n1、单因素选择单因素选择n2 2、正交设计、正交设计多因素选择多因素选择37PPT课件381、单因素选择比色法测溶菌酶活性单因素选择比色法测溶菌酶活性n以染料艳红以染料艳红K-2BP标记标记的的MLysodeikticus为为底物底物，分解后产生游离，分解后产生游离染色碎片（产物）染色碎片（产物）n离心除去未分解底物，离心除去未分解底物，上清液比色上清液比色n吸收度为溶菌酶活力的吸收度为溶菌酶活力的函数函数。38PPT

29、课件39测定条件选择测定条件选择S pHn（1）酶反应）酶反应底物浓度底物浓度曲线曲线n以染料标记的以染料标记的MLysodeikticus为底物，酶量为为底物，酶量为20g时，时，1%底物浓度已接近使酶饱和。底物浓度已接近使酶饱和。n（2）酶反应）酶反应PH曲线曲线n磷酸缓冲液和柠檬酸磷酸缓冲液和柠檬酸磷酸缓冲磷酸缓冲液。液。n不同组分的缓冲液，其最适不同组分的缓冲液，其最适PH稍有不同，选用稍有不同，选用pH6.5磷酸缓冲磷酸缓冲液。液。39PPT课件40测定条件选择离子强度测定条件选择离子强度、反应时间及、反应时间及En（3）离子强度离子强度对酶反应的影响对酶反应的影响n离子强度在离子强

30、度在0.3mol/L以上为宜，以上为宜，选用选用0.5mol/L。n（4）酶反应过程曲线）酶反应过程曲线(反应时反应时间间)和和酶浓度酶浓度曲线曲线n酶量为酶量为20 g时，反应在时，反应在30分分钟以内，吸收度与反应时间有钟以内，吸收度与反应时间有良好的线性关系，测定系统选良好的线性关系，测定系统选用用15分钟分钟。n酶量在酶量在50g之内之内，吸收度与酶，吸收度与酶浓度具有线性关系。浓度具有线性关系。40PPT课件41测定条件测定条件n1%染色菌体染色菌体缓冲液缓冲液1mln37水浴保温约水浴保温约5分钟分钟n加加酶试样酶试样0.5ml准确反应准确反应15分钟分钟n加入酸加入酸/乳化剂混合

31、液乳化剂混合液2ml，终止反应，反，终止反应，反应液经离心，上清液于应液经离心，上清液于540nm比色，所得比色，所得吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中溶菌酶含量。溶菌酶含量。41PPT课件42二、正交设计多因素选择二、正交设计多因素选择n正交试验设计（正交试验设计（Orthogonal experimental design）是一种高效的）是一种高效的利用正交表来安排多利用正交表来安排多因素多水平设计试验因素多水平设计试验的方法。的方法。n通过巧妙的安排和分组，通过巧妙的安排和分组，用较少的试验次数，用较少的试验次数，就能就能分析各因素的作用大小分析各因

32、素的作用大小，找出最佳的试验，找出最佳的试验条件。条件。n利用各因素所对应指标的利用各因素所对应指标的极差极差R及平均极差及平均极差D作出判断。作出判断。42PPT课件43正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件n中性蛋白酶是一种中性蛋白酶是一种蛋白水解酶蛋白水解酶，活力测定以，活力测定以酪蛋酪蛋白为底物白为底物，水解产物与福林试剂在碱性情况下反，水解产物与福林试剂在碱性情况下反应生成有色物质，于应生成有色物质，于680nm处测定吸收值处测定吸收值。n中性蛋白酶作用受中性蛋白酶作用受缓冲液的缓冲液的pH值、底物浓度、值、底物浓度、反应时间反应时间及及酶浓度酶浓度等因

33、素的影响。等因素的影响。n供试品：供试品：0.01%的中性蛋白酶溶液。的中性蛋白酶溶液。n底物：酪蛋白底物：酪蛋白43PPT课件44实验方案实验方案 n实验取四个因素：实验取四个因素：PH值、底物浓度、值、底物浓度、反应时间、酶浓度反应时间、酶浓度。n每个因素选三水平，属于多因素多水平，每个因素选三水平，属于多因素多水平，为此选用为此选用L9（34）正交表进行实验。正交表进行实验。44PPT课件4545PPT课件46正交试验表正交试验表n 实验号A缓冲液pH 值B底物浓度(%)C反应时间(min)D酶浓度（U/ml）111112122231333421235223162312731328321

34、39332146PPT课件47正交实验安排表正交实验安排表n n 47PPT课件48正交实验安排表正交实验安排表48PPT课件49各因素试验值计算结果各因素试验值计算结果 n平均极差越大，对应的因素影响越大。平均极差越大，对应的因素影响越大。n缓冲液缓冲液PH值值7.2，底物浓度，底物浓度0.5%，酶浓度用，酶浓度用100U/ml为最佳反应条件。为最佳反应条件。n反应时间为反应时间为10，20，30min，对，对OD值无显著影响。值无显著影响。49PPT课件50各因素试验值的方差分析各因素试验值的方差分析 结论：结论：PH值（值（A）、底物浓度（底物浓度（B）、酶浓度（酶浓度（D）为非常显著因

35、子；为非常显著因子；反应时间（反应时间（C）为非显著因子。）为非显著因子。50PPT课件51第五节第五节 酶类药物的检测酶类药物的检测 n肽键水解酶肽键水解酶 n脂键水解酶脂键水解酶 n糖苷键水解酶糖苷键水解酶 n其它（超氧化物歧化酶）其它（超氧化物歧化酶）51PPT课件52一、肽键水解酶一、肽键水解酶n1、胰蛋白酶、胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶、弹性蛋白酶n3、尿激酶、尿激酶52PPT课件53PPT课件541、胰蛋白酶、胰蛋白酶（Trypsin）n胰蛋白酶（胰蛋白酶（Trypsin）：由：由动物胰脏中提取的一种蛋动物胰脏中提取的一种蛋白水解酶白水解酶。n牛胰蛋白酶：牛胰蛋白酶：223个氨基酸，分

36、子量个氨基酸，分子量24000，等电点等电点10.1。n猪胰蛋白酶：猪胰蛋白酶：214个氨基酸，分子量个氨基酸，分子量23400，等电点等电点10.8。n胰蛋白酶最适胰蛋白酶最适pH为为7.68.0，电泳纯的胰蛋白酶的比，电泳纯的胰蛋白酶的比活为活为8000单位单位/mg。54PPT课件胰蛋白酶胰蛋白酶55PPT课件56胰蛋白酶胰蛋白酶56PPT课件57原理原理n胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等胰蛋白酶专一作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸碱性氨基酸的羧的羧基组成的基组成的肽键、酰胺键及酯键肽键、酰胺键及酯键，水解速度为，水解速度为酯键酯键酰胺酰胺键键肽键。肽键。nBAEE(Benzoyl-L

37、-Arginine-Ethyl-Ester)nBAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)n苯甲酰苯甲酰L精氨酸乙酯（精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，）在胰蛋白酶的作用下，酯键被水解生成苯甲酰酯键被水解生成苯甲酰L精氨酸，在精氨酸，在253nm波长处波长处的吸收度随酶促反应递增，因此连续记录不同时间的产的吸收度随酶促反应递增，因此连续记录不同时间的产物生产量，根据活力单位定义计算酶活力。物生产量，根据活力单位定义计算酶活力。57PPT课件58测定法：测定法：n取呈取呈直线的吸收度直线的吸收度，按下式计算：，按下式计算：nP为为每每mg供试品含胰蛋白酶的单位供试品含胰蛋白

38、酶的单位，U；A1为直线上终止的吸收度；为直线上终止的吸收度；nA2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；nT为为A1至至A2读数的时间，读数的时间，min；nW为测定液中供试品的量，为测定液中供试品的量，mg；n吸收度每分钟改变吸收度每分钟改变0.003，即相当于，即相当于1个胰蛋白酶单位个胰蛋白酶单位。58PPT课件下文为中国药典下文为中国药典2012015 5版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，版胰蛋白酶活力测定方法，请仔细阅读，并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？并阐述此酶活力测定的原理？其酶活力测定方法属于哪一种？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文

39、缩写？胰蛋白酶作用位点有哪些？写出测定所用底物的英文缩写？供试品的制备：精密称取本品适量，用盐酸（供试品的制备：精密称取本品适量，用盐酸（0.001mol/L0.001mol/L）制成每）制成每1ml1ml中中含含50506060胰蛋白酶单位的溶液。胰蛋白酶单位的溶液。底物溶液的制备：取底物溶液的制备：取N-N-苯甲酰苯甲酰-L-L-精氨酸乙酯盐酸盐精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg85.7mg，加水溶解使成，加水溶解使成100ml100ml，作为底物原液；底物溶液应在制成后，作为底物原液；底物溶液应在制成后2 2小时内使用。小时内使用。测定法：取底物溶液测定法：取底物溶液3.0ml3.0ml，加盐

40、酸溶液（，加盐酸溶液（0.001ml/L0.001ml/L）0.2ml0.2ml，混匀，作为，混匀，作为空白，取供试品溶液空白，取供试品溶液0.2ml0.2ml加底物溶液（预热至加底物溶液（预热至25250.50.5）3.0ml3.0ml，立即计，立即计时并摇匀，使比色池内温度保持在时并摇匀，使比色池内温度保持在25250.50.5，照紫外可见分光光度法在，照紫外可见分光光度法在253nm253nm的波长处，每隔的波长处，每隔3030秒种读取吸收度，共秒种读取吸收度，共5 5分钟。每分钟。每3030秒钟吸收度的变秒钟吸收度的变化率应恒定在化率应恒定在0.0150.0150.0180.018之间

41、，呈线性关系的时间不得少于之间，呈线性关系的时间不得少于3 3分钟。若不分钟。若不符合上述要求，应调整供试品的溶液浓度，另行测定。以吸收度为纵坐标，符合上述要求，应调整供试品的溶液浓度，另行测定。以吸收度为纵坐标，时间为横坐标做图，取在时间为横坐标做图，取在3 3分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。分钟内成直线部分的吸收度，按下式计算。式中式中 P P为每为每1mg1mg供试样品中胰蛋白酶的单位数；供试样品中胰蛋白酶的单位数；A A1 1为直线上终止的吸收度；为直线上终止的吸收度；A A2 2为直线上开始的吸收度；为直线上开始的吸收度；T T为为A A1 1至至A A2 2读数的时间（分）；

42、读数的时间（分）；W W为测定液中供试品的量；为测定液中供试品的量；0.0030.003为上述条件下，吸收度每分钟改变为上述条件下，吸收度每分钟改变0.0030.003相当于一个胰蛋白酶单位。相当于一个胰蛋白酶单位。59PPT课件课件60 2、胰胰弹性蛋白酶弹性蛋白酶（Elastase）n肽键水解酶肽键水解酶，存在于哺乳动物胰脏。，存在于哺乳动物胰脏。n胰弹性蛋白酶是由胰弹性蛋白酶是由240个氨基酸组成的单一肽链，个氨基酸组成的单一肽链，有四对二硫键。分子量为有四对二硫键。分子量为25900，等电点为，等电点为9.5。n胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可

43、以水解血红蛋白、酪蛋白等蛋白。血红蛋白、酪蛋白等蛋白。n刚果红弹性蛋白刚果红弹性蛋白。60PPT课件61胰胰弹性蛋白酶测定弹性蛋白酶测定原理原理n刚果红弹性蛋白法刚果红弹性蛋白法：以刚果红：以刚果红弹性蛋白为底物，弹性蛋白为底物，由于刚果红由于刚果红弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解，弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解，根据根据刚果红在刚果红在495nm处有最大吸收，由标准曲线即可查处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。得弹性酶单位数。n单位：单位：20分钟水解分钟水解1mg刚果红弹性蛋白刚果红弹性蛋白所需的酶量为所需的酶量为一个弹性酶活力单位一个弹性酶活力单位。61PPT课件62方法

44、方法:n 62PPT课件633、尿激酶、尿激酶（Urokinase）n由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。n主要作用是激活人体内主要作用是激活人体内纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原使其成为使其成为有活性的有活性的纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。溶解血栓。n天然尿激酶的分子量为天然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶蛋白溶解酶。63PPT课件64效价测定原理效价测定原理(气泡上升法气泡上升法)n尿激酶尿激酶激活人体内

45、激活人体内纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原使其转化成使其转化成纤维蛋白溶酶纤维蛋白溶酶；n纤维蛋白原纤维蛋白原在在凝血酶凝血酶的作用下，转变成的作用下，转变成纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块，此凝块在，此凝块在纤维蛋纤维蛋白溶酶白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。作用下，水解为可溶性小分子多肽。n在在纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶原过量的情况下，过量的情况下，尿激酶量尿激酶量与与纤维蛋白凝块的溶解时间纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。的对数成直线关系。64PPT课件65操作操作(气泡上升法气泡上升法)n试管中加试管中加纤维蛋白原纤维蛋白原溶液溶液0.3ml（37水浴）水浴）n标准品标准品(或供试品或供

46、试品)1.0mln加混合溶液加混合溶液0.4mln立即摇匀计时，立即摇匀计时，反应系统应在反应系统应在3045秒内凝结秒内凝结，当当凝块内小气泡上升到系统体积一半时凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应作为反应终点。终点。n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。纵坐标。65PPT课件66二、脂键水解酶二、脂键水解酶 胰脂肪酶胰脂肪酶(Pancreatic Lipase)n胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把甘甘油三脂类脂肪油三脂类脂肪水解，最后生成水解，最后生成甘油及脂肪酸甘油及脂肪酸。n底物底物:橄榄

47、油橄榄油n用已知浓度的用已知浓度的标准碱溶液标准碱溶液滴定，可定量地测滴定，可定量地测定定脂肪酸脂肪酸的量，从而得知的量，从而得知脂肪酶脂肪酶活力。活力。66PPT课件67测定测定n 67PPT课件68计算计算n每分钟每分钟水解橄榄油水解橄榄油产生产生1mol脂肪酸脂肪酸的酶量，的酶量，为为1个活力单位。个活力单位。n每克含有的胰脂肪酶单位每克含有的胰脂肪酶单位nA:供试品消耗供试品消耗NaOH（0.1mol/L）的体积）的体积nB:空白消耗空白消耗NaOH（0.1mol/L）的体积）的体积nW:供试品取样量（供试品取样量（g）nN:供试品稀释倍数。供试品稀释倍数。68PPT课件69三、糖苷键

48、水解酶三、糖苷键水解酶 溶菌酶溶菌酶n蛋清中提取的能蛋清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶分解粘多糖的碱性水解酶。n溶菌酶溶菌酶（Lysozyme）具有抗菌、抗病毒等作具有抗菌、抗病毒等作用。用。n溶菌酶分子量为溶菌酶分子量为1400015000，由，由129个氨基个氨基酸残基组成，等电点为酸残基组成，等电点为10.011.1。n溶菌酶属糖苷溶菌酶属糖苷键键水解酶，能以某些细菌细胞中水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。的多糖为底物。69PPT课件70溶菌酶作用位点溶菌酶作用位点70PPT课件71青霉素青霉素转肽酶底物转肽酶底物末端的二肽末端的二肽D-Ala-D-Ala结构结构71PPT课件7

49、2效价测定比浊法效价测定比浊法n以以溶酶小球菌溶酶小球菌为底物，主要成分为为底物，主要成分为粘多糖粘多糖，粘多，粘多糖由糖由NAG和和NAM重复而成。重复而成。n只能水解只能水解NAM C1 和和NAG C4之间的之间的1，4糖糖苷键苷键。n溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后，导致导致溶菌溶菌，溶液的，溶液的吸收度下降吸收度下降。n在一定的条件下，每分钟在一定的条件下，每分钟吸收度下降吸收度下降0.001为一为一个酶活力单位。个酶活力单位。72PPT课件73比浊法测定比浊法测定n计算：计算：n酶活力单位（酶活力单位（u/mg）=nW为测试液中

50、供试品为测试液中供试品的重量（的重量（g）73PPT课件74比色法比色法-测定溶菌酶活性测定溶菌酶活性 n用染料艳红用染料艳红K2BP标记的标记的M.Lysodeikticus为底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片为底物，酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片（产物）（产物）n反应后离心除去未分解底物，上清液比色，反应后离心除去未分解底物，上清液比色，吸吸收度为溶菌酶活力的函数收度为溶菌酶活力的函数。74PPT课件75溶菌酶效价测定比色法溶菌酶效价测定比色法n 75PPT课件76四、超氧化物歧化酶四、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）n由由动物红细胞动物红细胞制得的金属酶，