dna 实验.ppt

1、分子生物学实验分子生物学实验腺嘌呤脱氨酶基因工程菌的构建腺嘌呤脱氨酶基因工程菌的构建日日8AM5PM TA质粒（含质粒（含ade基因）基因）pMal-c2x质粒质粒双酶切双酶切 电泳电泳双酶切产物片段的回收双酶切产物片段的回收目的基因与载体片段连接（过夜）目的基因与载体片段连接（过夜）实验内容：酶切和连接反应实验内容：酶切和连接反应E.coli TB1菌株37过夜培养，第二天做感受态细胞用。一一8AM5PM实验内容：实验内容：感受态细胞的制备和转化感受态细胞的制备和转化 原理原理 1.细菌在0C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。2.质粒DNA粘附在细

2、菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。二二1PM5PM实验内容：实验内容：挑单斑，摇菌l收平板l挑取单斑（白斑）l摇菌：3050mL,用于提取质粒三三8AM5PM质粒提取质粒提取实验内容：实验内容：转化克隆的筛选和鉴定转化克隆的筛选和鉴定电泳观察电泳观察PCR筛选筛选双酶切鉴定双酶切鉴定 双酶切反应双酶切反应TA质粒和pMal-c2x质粒分别以EcoR（GAATTC）和Sal（GTCGAC）进行双酶切，20L质粒酶切反应体系如下：TA质粒 pMal-c2x质粒 7L 9L 10EcoR

3、缓冲液 2L 2L BSA 0.2L 0.2L 水 0.8L 0.8L EcoR 0.5L 0.5L Sal 0.5L 0.5L 无菌水 9L 7L 37酶切反应2小时。注意事项：注意事项：内切酶要放到最内切酶要放到最后加入后加入电泳及凝胶回收电泳及凝胶回收琼脂糖凝胶电泳检验酶切产物，使用使用UNIQ-10柱柱式凝胶回收试剂盒式凝胶回收试剂盒分别对目的基因片段（TA质粒酶切反应中得到的1.7Kb片段）和载体片段（pMal-c2x质粒酶切反应中得到6.6Kb片段）进行凝胶回收。1.Excise the DNA fragment from the agarose gel with a clean,

4、sharp scalpel.Weigh the gel slice and transfer to a 1.5-ml microfuge tube.2.Add 400 ml of Binding Buffer to 1 volume of gel(100 mg=100 ml).Incubate at 50-60 for 10 minutes and shake occasionally until agarose is completely dissolved.3 Place a spin column in a 2-ml collection tube.Transfer the above

5、mixture solution to the spin column.Let it stand for 2 minutes.Spin at 8,000 rpm for 1 minute and discard the flow-through in the tube.4.Add 500 ml of Wash Solution,and spin at 8,000 rpm for 1 minute.Discard the solution in the tube.5.Repeat step 4.Spin at 10,000 rpm for additional 30 seconds to rem

6、ove residual Wash buffer.6.Place the column in a new clean 1.5-ml microfuge tube.Add 30-40 ml of Elution Buffer to the center part of the membrane of the column and incubate at 37 or 50 for 2 minutes.Spin at 10,000 rpm for 1 minute to elute DNA.Store the DNA elution in 20 freezer.Binding Buffer 是否有沉

7、淀可适当延长时间可适当延长时间Wash Solution中加中加入乙醇的比例入乙醇的比例洗脱时间延长洗脱时间延长！注意任一步骤的残液不要倒掉注意任一步骤的残液不要倒掉以防丢失目的以防丢失目的DNA连接反应连接反应 在灭菌的0.5mL离心管中进行。10L体积反应体系中：2快速连接缓冲液 5L 目的基因的双酶切产物 XL pMal-c2x质粒双酶切产物 XL T4-DNA连接酶 0.3L 轻轻混匀，室温下放置过夜。注意事项：注意事项：目的基因和 c2x质粒双酶切产物的加入比例应根据电泳结果而定，使加入的2片段的浓度比为1：1剩下的酶切片段不要丢掉，留做转化时做对照剩下的酶切片段不要丢掉，留做转化时

8、做对照感受态菌的制备感受态菌的制备（1）E.coli TB1菌株37过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液1mL加入到50 mL LB培养基中，37，230 r/min振荡培养3 h，至A600约为0.4左右。（2）无菌条件下，将50mL菌液转移至离心管中，冰上放置10 min，使培养物冷却至0。（3）在预冷4的离心机上以4000 r/min离心10min，弃去上清，加入5mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置10 min。（4）以4000r/min在4离心10min，弃去上清，每50mL初始培养物用2mL预冷的含有10%20%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉

9、淀，100L/管分装，于-70条件下，可保存半年。注意事项：注意事项：1.细胞一旦离开培养基，实验操作要轻柔2.整个实验过程中注意将细胞置于冰上不能摇过了！选用处于对数生长期的细胞预先冷却pMal-adepMal-ade重组质粒的转化重组质粒的转化（1）向分装有100LE.coli TB1菌株感受态细胞的EP管中加入2 L的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置30 min。（2）将该EP管放入预加温至42的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却12 min。（3）向EP管加入900 L LB培养基，转移至37摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株。（

10、4）将200L上述培养物加到含100g/mL氨卞青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40L和20mg/mL的IPTG 40L），以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。（5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37过夜培养；水浴温度要准确，热击时不要摇动EP管UNIQ-10UNIQ-10柱式质粒小量抽提柱式质粒小量抽提1 将过夜培养的12ml细菌12,000rpm离心15秒，彻底去除上清。l2 加入100ml Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。l3 加入200 ml Solution II，立即温和混匀（倾斜45度角，顺一个方向，慢慢旋转

11、离心管），使细菌裂解，室温放置2分钟。l4 加入350ml Solution III，立即上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置2分钟。l5 12,000rpm，离心5分钟。l6 将步骤5中上清转移到套放于2.0-ml收集管内的UNIQ-10柱中，8,000rpm室温离心15秒。l7 弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500ml Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室温离心30秒。l8 重复步骤7。l9 弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，10,000rpm室温离心30秒以彻底去除Wash Solution。l10 将

12、UNIQ-10柱放入新的洁净1.5-ml离心管中，加50ml Elution Buffer，室温放置2分钟后，10,000rpm室温离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。l注意：对于低拷贝数的质粒，请用注意：对于低拷贝数的质粒，请用25ml细胞，同时按比例相应提高细胞，同时按比例相应提高Solution I，II和和III的用量。在执行步骤的用量。在执行步骤5后，将上清分批加入到后，将上清分批加入到UNIQ-10柱中，重复步骤柱中，重复步骤6，直，直至处理完所有样品。至处理完所有样品。l注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染污染。注意：不

13、要吸取沉淀，否则会出现基因组注意：不要吸取沉淀，否则会出现基因组 DNA和蛋白质污染。和蛋白质污染。l注意：（注意：（1）如果要提高质粒的浓度，可以用）如果要提高质粒的浓度，可以用30m ml Elution Buffer，37或或50下放置下放置2分钟，分钟，10,000rpm室温离心室温离心1分钟。分钟。（2）5580洗脱可提高回收率洗脱可提高回收率1020个百分点。个百分点。PCR筛选筛选1、调整模板（pMal-ade重组质粒）浓度至 5 ng/L。2、按下列体系配制反应混合液，混匀，Template DNA 1.0 L（20 ng）10 buffer 2.0 LMgCl2（25mmol

14、/L）1.5 LPrimer 1(10mol/L)0.5 LPrimer 2(10mol/L)0.5 LdNTPs（2mmol/L）2.0 LTaq酶（5U/L）0.5L加ddH2O至 20L外源基因的特异引物：引物1（5-CCG GAA TTC TTG AAT AAA GAA GCG CTA GTC3）和引物2（5-CGG GGA TCC GTC GAC TTA TTG CAG TGA TAT GTG TTG3）。3PCR 反应循环条件设置 94变性反应1min；55退火反应45s；72延伸反应1min。进行25个循环后，最后一个循环72延长至10min。迅速冷却4。4、检测 加 2L溴酚蓝和10L 反应产物，混匀，取 15L 反应产物点样电泳。5、成像分析 在 1%的琼脂糖凝胶上点样电泳0.51h，电泳结束后EB 染色1520min，凝胶成像分析结果。