血红蛋白的提取和分离知识点填空(DOC 5页).doc
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1、专题五 课题3血红蛋白的提取和分离一、基础知识(一)血红蛋白提取与分离的依据1. 2. 3. 4. 5. (二)原理1凝胶色谱法凝胶色谱法也称做 ,是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体,在小球体内部有许多贯穿的通道,相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同,相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道,路程 ,移动速度 ;而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在 移动,路程 ,移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。具体过程:凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质(1)(2)(3)(4)(5)BA多孔板A 的蛋白质
2、由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留; 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面,在了里之间迅速通过。B(1) 混合物上柱;(2)洗脱开始, 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内; 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外;(3) 的蛋白质被滞留; 的蛋白质被向下移动。(4) 不同的蛋白质分子完全分开;(5) 的蛋白质行程较短,已从 中洗脱出来, 的蛋白质还在行进中。2缓冲溶液缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的,例如:血浆的pH是 ,要在实验条件下准确模拟生物体内的过程,必须保持体外的pH与体内的基本一致。思考:说出人体血液中缓冲对? 思考:在血红蛋白
3、整个实验室中用的缓冲液是什么?它的目的是什么?3电泳(1)概念:电泳是指 。(2)原理:许多重要的生物大分子,如 等都具有 , 在 下,这些基团会带上 。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ,从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是 和 ,在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 以及 等因素。4蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步: 、 、 和 。思考:是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的?为什么?5样品处理血液由 和 组成,其中红细胞最多。红细胞
4、具有 的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质 ,其作用是 ,血红蛋白有 个肽链组成,包括 ,其中每条肽链环绕一个 ,磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红色。红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ,采集的血样要及时采用 分离红细胞,然后用胶头吸管吸出上层透明的 ,将下层暗红色的 倒入烧杯,再加入 ,缓慢搅拌 ,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至 ,表明红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放 在 和 作用下,红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后,试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ,第2层为白色薄层固体,是 ,第3层是红色透明液体,这是 ,第4层是其他杂质的暗红色
5、沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤,除去之溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中,将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中,透析12h。透析可以去除样品中 的杂质,或用于更换样品的 。6凝胶色谱操作第一步要制作 ,第二步要 ,因为 ,所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时,不得有 存在。因为气泡会 ,降低分离效果。第三步是 。用凝胶色谱法分离蛋白质时,分子量大的蛋白质 A路程较长,移动速度较慢 B路程较长,移动速度较快C路程较短,移动速度较慢 D路程较短,移动速度较快二、实验操作1样品
6、处理 (1)红细胞的洗涤目的:去除 方法: ,离心速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果,然后用胶头吸管吸出上层透明的 ,将下( 的红细胞液体倒入 再加入用 质量分数为09的氯化钠溶液洗涤。低速离心(低速短时间)重复4、5步骤 次,直至上清液中已没有 ,表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化,不可洗涤次数过少。(2)血红蛋白的释放加 到 体积,再加40体积的 ,置于 上充分搅拌10分钟加速细胞破裂, 细胞破裂释放出血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液:将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min的速度离心10 min ,试管中的溶液分为4层:第1层(最上层): 甲苯
7、层第2层(中上层): 的沉淀层, 色薄层固体第3层(中下层): 的水溶液层, 的液体第4层(最下层):其它杂质 的沉淀层(4)透析2凝胶色谱制作1)凝胶色谱柱的制作2)凝胶色谱柱填料的处理(1)凝胶的选择: 。(2)方法: 配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后,配成 。(3)凝胶色谱柱的装填方法 固定:将色谱柱处置固定在支架上装填:将 一次性的缓慢倒入 内,装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。洗涤平衡 装填完毕后,立即用缓冲液洗脱瓶,在( )高的操作压下,用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液(pH为70)充分 12小时。3)样品加入与洗脱(1)加样前:打开下端出口
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