体外细胞培养的污染和控制.ppt

1、细胞体外培养中的污染和控制污染的定义 细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。体外细胞培养污染可分为3 类：物理性、化学性及生物性污染。物理性污染 物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射（紫外线或荧光）会对细胞产生影响。细胞、培养液或其他培养试剂暴露在放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制，甚至细胞死亡。物理性污染 1、实验室的合理设计及建立规范的操作规程；2、培养箱应放在恒温的环境中；3、培养液及试剂应放在固定的位置，而且要注意避光，试剂

2、周围不能放置同位素；4、从冰箱中取出的培养液应在室温条件中放置一段时间后再进行使用，以避免过冷的温度对细胞的影响。化学性污染 未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分（如氨基酸）若浓度超过了合理的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系在最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。化学性污染 1、使用的所有物质都应是高纯度的,同时正确配制和储存培养液及试剂；2、在配制液体和清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。3、选用同一批次的血清。4、在选用器皿时，根据被培养细胞的生长特性、培养方式和所用培养液的性质来选用

3、适合的器皿来达到实验的准确性和可靠性。生物性污染 常见的生物性污染：一、细菌：G+菌较多。二、真菌：霉菌较多。三、支原体：不易检测。四、病毒：由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。污染来源及鉴别 来源：1.取材不慎或处理不当 2.空气尘埃 3.消毒不严 4.操作不当 5.试剂尤其是血清污染细菌污染 大多数细菌（bacteria）污染可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞。细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。细菌污染真菌污染 真菌（fungus）污染易于发现，一

4、般在培养液中有肉眼可见的白色或浅黄色的漂浮小点，念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间，个体细小，有增多趋势，培养液一般不 混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。培养细胞受真菌污染后，细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒 性作用可使细胞脱落、死亡。支原体污染 支原体（mycoplasma）是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，直径0.22m左 右，无细胞壁，对理化因素比较敏感。受污染的细胞在显微镜下无特殊的外观表现，培养液也不浑浊；部分敏感细胞生长增殖变慢，细胞变圆，脱落。在细胞培养过 程中，如在显微镜下发现破碎的细胞有许多，培养物需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应怀疑培养物可能受支原体污染。支原体可通过培养法、DNA荧光染色法、聚合酶链式反应、免疫学等方法进行检测。生物性污染的控制 1、建立规范的无菌操作程序及各种规章制度，并严格执行；2、控制环境污染，同时注意实验人员的防护及无菌服的洁净和无菌；3、保证细胞培养基和器材无菌；4、在细胞培养基中加入适量的抗生素。