转基因产品检测培训教材课件.ppt

1、2023年4月28日星期五转基因产品检测培训教转基因产品检测培训教材材交流的主要内容交流的主要内容全球转基因农作物种植情况国际、国内转基因生物安全管理转基因产品检测技术核酸DNA提取SGS GMO检测报告解读全球转基因农作物种植情况全球转基因农作物种植情况1996-20111996-2011年全球转基因作物增长趋势年全球转基因作物增长趋势1.48亿公顷，占全球农作物种植面积的10%主要转基因作物种植情况主要转基因作物种植情况大豆大豆玉米玉米棉花棉花油菜油菜主要转基因农作物种植比例主要转基因农作物种植比例常规作物常规作物转基因作物转基因作物转基因农作的主要性状转基因农作的主要性状转基因农作物种植

2、分布转基因农作物种植分布2010年全球转基因植物面积达到1.48亿公顷,涉及24种作物184个品系，种植国家有29个，发达国家占10个。共有59个国家批准转基因作物的种植和进口，包括美国、日本、加拿大、墨西哥、澳大利亚、南非、欧盟、中国等。玉米最多有60个品系批准应用，其次是棉花（35）、油菜（15）、大豆（14）。国际、国内转基因生物国际、国内转基因生物安全管理安全管理国际组织对转基因生物安全管理国际组织对转基因生物安全管理国际食品法典委员会（CAC）联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）于1963年联合创立的，其职责在于保护消费者健康，保证开展公正的食品贸易和协调所有食品标准的制

3、定工作。最早提出应用风险分析原则进行食品安全管理。165个成员国。1999年食品法典委员会建立了政府间特设生物技术食品工作组,在转基因领域制定风险分析原则和指南在转基因领域制定风险分析原则和指南 2000年发布了关于转基因植物性食物的健康安全性问题的文件，运用“实质等同性实质等同性”概念建立有效的安全性评估框架。http:/ 并于2003年7月1日，在罗马召开的联合国食品标准署会议上，国际食品法典委员会通过了三项有关生物技术食品的原则和准则，即“现代生物技术食品风险分析原则”（CAC/GL44-2003）“重组DNA植物食品安全评估准则”（CAC/GL45-2003）“重组DNA微生物食品安全

4、评估准则”（CAC/GL46-2003）食品法典委员会设立了食品标签法规委员会(The Codex Committee on Food Labelling，CCFL)2006年CCFL第34届会议上通过建议一个实体工作组（physical Working Group）讨论转基因食品标识的主要问题国际食品法典委员会（CAC）经济合作与发展组织（OECD）经济合作与发展组织，简称经合组织（OECD），是由34个市场经济国家组成的政府间国际经济组织，旨在共同应对全球化带来的经济、社会和政府治理等方面的挑战，并把握全球化带来的机遇。1986年，蓝皮书重组DNA安全性考虑 转基因生物总体指南1992年，

5、生物技术安全性考虑1992 明确生物安全的概念和原则 1992年，生物技术作物田间试验安全考虑 确定分阶段原则和个案原则1993年，现代生物技术加工食品风险评估概念和原理实质等同原则，现在有67个国家把这一原则作为转基因食品安全评估的基本原则。1995年以来，风险评估信息共享，已出版65个生物安全共识文件 http:/www.oecd.org/topic/0,3699,en_2649_34385_1_1_1_1_37401,00.htm国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO)是一个全球性的非政府组织，1946年成立于

6、瑞士日内瓦,负责制定在世界范围内通用的国际标准,ISO现有117个成员，包括117个国家和地区。ISO转基因食品检测标准技术委员会（ISO TC34/SC16），主管转基因食品国际标准的制修订工作。技术委员会负责起草国际标准，通过一致的标准来消除现存的贸易壁垒，推进国际商品和服务的交流。目前为止，ISO制订6个转基因生物产品检测标准。转基因产品成分检测ISO标准一般性原则和要求蛋白检测采样核酸检测核酸提取定性PCR检测定量PCR检测核酸检测方法增补原则ISO 24276:2006，General requirements and definitions ISO 21571:2005Nuclei

7、c acid extraction ISO 21570:2005 Quantitative nucleic acid based methods ISO 21572:2004Protein based method ISO/TS 21098:2005 Information to be supplied and procedure for the addition of methods toISO 21569,ISO 21570 orISO 21571 prEN ISO 21568:2005Sampling21569:2005Qualitative nucleic acid based met

8、hods 发达国家转基因生物安全管理规定各国均以风险分析为基础，理念、内容、方法无明显差异，不各国均以风险分析为基础，理念、内容、方法无明显差异，不同的战略选择和政策导向形成不同的管理模式同的战略选择和政策导向形成不同的管理模式 美国模式美国模式，以产品为基础，风险分析中应用，以产品为基础，风险分析中应用“可靠科学原则可靠科学原则”只要在科学上无法证明它有危险性，就不应该限制只要在科学上无法证明它有危险性，就不应该限制 欧盟模式欧盟模式，以过程为基础，风险分析中应用预防原则，以过程为基础，风险分析中应用预防原则 只要不能否定其危险性，就应该限制只要不能否定其危险性，就应该限制 日本模式日本模式

9、，以过程为基础，风险分析中应用，以过程为基础，风险分析中应用“可靠科学可靠科学”美、欧、日等，重视转基因生物的安全管理，通过立法美、欧、日等，重视转基因生物的安全管理，通过立法和技术指南规范研发和应用行为和技术指南规范研发和应用行为欧盟转基因生物安全管理欧盟转基因生物安全管理法律体系分为指令Directive和法规Regulation两个层次，颁布的法令在各国采纳后对采纳的国家有效，颁布的法规则直接有效。按照预防原则对转基因生物进行单独立法管理按照预防原则对转基因生物进行单独立法管理欧洲食品安全局负责风险评价，欧洲食品安全局负责风险评价，负责GMOs的审批和市场投放,实施从农田到餐桌的实施从农

10、田到餐桌的的各环节进行监监控，控，保证转基因产品的可追溯性l指令指令2001/18/EC转基因生物有意环境释放转基因生物有意环境释放规范任何可能导致转基因生物与环境接触行为规范任何可能导致转基因生物与环境接触行为l法规法规1829/2003/EC转基因食品和饲料管理条例转基因食品和饲料管理条例转基因食品审批和执行制度转基因食品审批和执行制度l法规法规1830/2003/EC转基因生物追溯性及标识办法转基因生物追溯性及标识办法以及含转基因生物成分的食品及饲料产品的追溯性以及含转基因生物成分的食品及饲料产品的追溯性管理条例管理条例转基因食品追踪和标识制度转基因食品追踪和标识制度欧盟法规欧盟法规美国

11、转基因生物安全管理美国转基因生物安全管理1976年，国家卫生研究院（NIH）重组DNA分子研究指南全球首个转基因技术安全管理法规 全球首个转基因技术安全管理法规，对重组DNA研究项目的进行审查、评价和监控1986年颁布了生物技术法规协调框架 将基因工程工作纳入现有法规进行管理，由农业部、环保署和食品药品管理局在现有的法规框架下协调管理转基因生物。农业部（USDA），管理目的是确保转基因生物（GMOs）的安全种植。有两个机构涉及该项工作，即：动植物检疫局（APHIS）和食品安全及检查局（FSIS）。环保署（EPA），负责管理转基因生物的环境释放。依照联邦杀虫剂、杀菌剂、杀鼠剂法、联邦食品、药物和

12、化妆品法对杀虫剂（包括植物杀虫剂，即转抗虫、抗病基因产生的蛋白质）进行管理。具体负责杀虫剂对农业的影响和确定或免除杀虫剂在食品中最高残留量的管理。食品与药物管理局（FDA），依照联邦食品、药物和化妆品法，负责食品和食品添加剂的安全管理，确保所转基因生产的蛋白质对人类健康的安全。-负责食品标识管理负责食品标识管理。美国管理部门美国管理部门日本转基因生物管理、法规日本转基因生物管理、法规日本在1979年制定了重组DNA实验管理条例，开始生物技术的安全管理。所涉及的部门主要是科学技术厅、通产省、农林水产省和厚生劳动省。科学技术厅：依照重组DNA实验准则，规范实验室和封闭温室的研究，负责审批试验阶段的

13、重组DNA研究。厚生劳动省（MHLW)：依照重组DNA准则，负责对重组DNA技术生产药品和食品的管理-食用安全。通产省（MITI)。：依照遗传工程体工业化准则，对将重组DNA技术的成果应用于工业化活动进行管理-饲料安全。农林水产省（MAFF）：依照农、林、渔及食品工业应用重组DNA准则负责管理GMO在农业、林业、渔业和食品工业中应用-环境、饲料安全。MAFF和MHLW分别颁布了食品标识体系，规范转基因食品标识标准。中国法律法规和制度要求中国法律法规和制度要求特点：特点：与国际组织及多数国家的理念、与国际组织及多数国家的理念、要求、做法一致要求、做法一致中国生物安全网，http:/ 2002年，

14、农业部农业转基因生物安全评价办法年，农业部农业转基因生物安全评价办法 2002年，农业转基因生物进口管理办法年，农业转基因生物进口管理办法 2002年，年，农业转基因生物标识管理办法农业转基因生物标识管理办法 2006年，农业转基因生物加工审批办法年，农业转基因生物加工审批办法 2004年，年，质检总局进出境转基因产品检验检疫管理办法质检总局进出境转基因产品检验检疫管理办法 一个条例，5个办法规范了农业转基因生物安全评价、进口安全管理、标识管理、加工审批、产品进出境检验检疫工作，形成了一整套适合我国国情并与国际接轨的法律法规、技术规程和管理体系。我国的法律法规制度我国的法律法规制度 国务院部际

15、联席会议，国务院部际联席会议，由农业、科技、环由农业、科技、环境保护、卫生、外经贸、检验检疫等有关境保护、卫生、外经贸、检验检疫等有关部门负责人组成。部门负责人组成。农业部农业转基因生物安全领导小组农业部农业转基因生物安全领导小组 农业部科技教育司（农业部农业转基因生农业部科技教育司（农业部农业转基因生物安全领导小组办公室）物安全领导小组办公室）国家农业转基因生物安全委员会及其秘书国家农业转基因生物安全委员会及其秘书处处管理机构管理机构农业部科技发展中心农业部科技发展中心（农业部农业转基因生物安全监管中心、农（农业部农业转基因生物安全监管中心、农业部植物新品种测试中心），承办国家生物安全专家委

16、员会秘书业部植物新品种测试中心），承办国家生物安全专家委员会秘书处的日常联络工作，是全国转基因标准化技术委员会秘书处挂靠处的日常联络工作，是全国转基因标准化技术委员会秘书处挂靠单位单位，全国转基因检测体系和机构能力建设、检测监测，全国转基因检测体系和机构能力建设、检测监测-农业部农业部转基因生物安全监督检验测试中心转基因生物安全监督检验测试中心等。等。基因安全管理处基因安全管理处，负责生物安全评价，负责生物安全评价等具体技术工作，承办两个秘书处及等具体技术工作，承办两个秘书处及生物安全网的具体事务。生物安全网的具体事务。农业转基因生物安全检定处农业转基因生物安全检定处，负责转，负责转基因检测体

17、系及机构能力建设、检测基因检测体系及机构能力建设、检测标准、全国性监测的具体技术工作。标准、全国性监测的具体技术工作。技术支撑机构技术支撑机构技术标准技术标准转基因产品检测技术转基因产品检测技术全球主要国家转基因产品标识管理情况全球主要国家转基因产品标识管理情况国家国家/地区地区标识类别标识类别标识阈值标识阈值国家国家/地区地区 标识类别标识类别标识阈值标识阈值中国强制0%印度尼西亚强制性5%欧盟强制性0.9%台湾强制性5%俄罗斯强制性0.9%泰国强制性5新西兰强制性1%菲律宾自愿性5%巴西强制性1%泰国强制性5沙特强制性1%加拿大自愿性5韩国强制性3%中国香港自愿性5%日本强制性5%南非自愿

18、无具体说明以色列强制性1%阿根廷自愿性无具体说明智利强制性2%美国自愿性无具体说明如何进行转基因产品的检测？如何进行转基因产品的检测？染色体水平 转录组水平 蛋白组水平 代谢组水平GMNon-GM？转基因产品检测一般流程转基因产品检测一般流程提取核酸或蛋白质核酸检测蛋白质检测或定性定性PCR定量定量PCR芯片检测芯片检测核酸测序核酸测序侧向流动侧向流动试纸条试纸条酶联免疫酶联免疫吸附吸附转基因生物检测基于蛋白的转基因检测方法基于蛋白的转基因检测方法1.酶联免疫吸附法（酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体

19、，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。最常见的检测方法是夹心法 将样品提取液加入包被有目标蛋白抗体的微孔将样品提取液加入包被有目标蛋白抗体的微孔板中，转基因植物表达的外源蛋白的抗体与被板中，转基因植物表达的外源蛋白的抗体与被检测样品中的外源蛋白结合。检测样品中的外源蛋白结合。加入用酶（辣根过氧化物酶）标记的目加入用酶（辣根过氧化物酶）标记的目标蛋白抗体，抗原抗体产生特异性结合。标蛋白抗体，抗原抗体产生特异性结合。洗涤以后，加入底物显色。辣根过氧化洗涤以后，加入底物显色。辣根过氧化物酶催化底物成有色产物，根据

20、颜色反物酶催化底物成有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量分析。应的程度进行该抗原的定性或定量分析。ELISA检测基本原理标记有蛋白抗体的酶标板标记有蛋白抗体的酶标板根据转基因标准物质绘制的标准曲线根据外源蛋白标准绘制的标准曲线根据抗原抗体特异性结合的原理工作。2 2、侧向流动型免疫试纸条方法、侧向流动型免疫试纸条方法快速检测试纸条法应用了双抗体夹心法，首先将CP4 EPSPS蛋白特异的抗体，偶连于显色试剂，并参入试纸条。当试纸条被插入含有CP4 EPSPS蛋白的植物组织的小量萃取物时，偶连抗体与蛋白之间就发生了结合，与偶连于显色试剂上的某些但不是全部抗体形成夹心物。膜片含有两个捕

21、获区，一个捕获区可捕获结合的CP4 EPSPS蛋白，另一个捕获区可捕获显色试剂。当夹心物和未反应的显色试剂被膜片上的特定区捕获时，这些捕获区就显现出红色。若膜片上仅存在一条红色对照线，便说明受检样品为阴性样品，若存在两条线，便说明受检样品为阳性样品。蛋白检测试剂盒蛋白检测试剂盒蛋白检测特点蛋白检测特点ELISA具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性，具有简便、快速、费用低等特点，但易出现本底过高的问题，且只能检测目的蛋白抗原性没有明显变化的粗加工产品。侧向流动免疫测定试纸条是一种很快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，510分钟就可得出结果，不需要特殊仪器和熟练技能。但一

22、种试纸条只能检测一种蛋白质，且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。基于核酸的转基因检测方法基于核酸的转基因检测方法35S promoterNOS terminatorCaMVAgrobacterium tumefaciens1.检测主要依据是目的DNA链与特定的生物大分子结合或者与特异序列的杂交2.目的DNA主要由具有特定功能的基因及其相应的调控元件组成。核酸检测方法策略核酸检测方法策略启动子基因内含子终止子筛选检测基因特异性检测构建特异性检测转化体特异性检测低植物基因组高Arne HA et al.,Euro Food Res Tech,2007植物基因组TGAACGTAGT

23、AGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTA

24、GAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA模板+引物+三磷酸脱氧核苷酸+Taq DNA聚合酶+PCR反应缓冲液（盐离子）定性定性PCR检测方法原理检测方法原理TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTC

25、TATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep 1:变性94C TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATG

26、CATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep 2:退火T 依赖于引物 CGTAGTAGCACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGGCTGCTACGTAGTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATT

27、GACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCT

28、AStep 3:延伸72CCGTAGTAGCACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGATGAACGTAGTA

29、GCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAG

30、AGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA量加倍TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACT

31、TGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA定性定性PCR产物电泳检测产物电泳检测DNA分子量大小对照检测产物定性定性PCRPCR检测关键因子检测关键因子引物设计PCR引物时使用辅助软件既可节省时间，也能避免犯错误。如Oligo、Primer Express、Primer Primier 5.0、Vector NTI suite 9 和 Primer Select(DNASTAR INC)等专业的引物设计软件。引物的碱基组成、长度及靶序列的特异性是决定PCR成败的关键。引物

32、是指DNA聚合酶启动DNA合成时必需的一段寡核苷酸，是PCR特异性反应的关键因素，PCR反应产物的特异性是由一对上下游引物所决定的。dNTPs是PCR反应过程中DNA合成的原材料。一般反应中每种dNTP的终浓度为20200 mol/L。三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）dNTP浓度过高，碱基的错误掺入率增加，低浓度的dNTP可提高特异扩增的精确性。反应体系中4种dNTPs的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。Taq DNA聚合酶最早是从一种嗜热水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株

33、中分离纯化获得的，后来在嗜热脂肪芽孢杆菌及其它几种耐热菌中也分离提纯到此类DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶 酶量过多会使非特异性扩增产物增加，过少则使产量降低。反应缓冲液 反应缓冲液一般含有1050 mmol/L TrisCl，50 mmol/L KCl和适当浓度Mg2+(一般为1.5 mmol/L MgCl2)。Mg2+浓度既影响酶的活性和真实性，又影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体形成等，因此，合适的Mg2+浓度是PCR的关键。必要时在反应缓冲液中还可加入5 mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100 g/ml的牛血清蛋白（BSA），以稳定Taq酶的活性。50 mmo

34、l/L的KCl有利于引物退火，高于75 mmol/L时PCR反应明显受到抑制。转基因产品定性转基因产品定性PCRPCR检测方法关键检测方法关键方法特异性9种转基因玉米检测方法的特异性示意图(A)：GA21玉米；(B)：NK603玉米；(C)：BT176玉米；(D)：CBH351玉米；(E)：MON863玉米；(F)：TC1507玉米；(G)：T25玉米；(H)：BT11玉米；(I)：MON810玉米；(J)：玉米内标准基因zSSIIb基因。泳道114分别是：空白对照、GA21玉米、NK603玉米、BT176玉米、CBH351玉米、MON863玉米、TC1507玉米、T25玉米、BT11玉米、M

35、ON810玉米、非转基因玉米、转基因大豆GTS 40-3-2、转基因油菜RT73和转基因MON531棉花；泳道M为DL2000 DNA分子量Marker.方法检测极限（LOD）相对LOD值，指的是能够检测到的最低转基因植物产品的含量，一般是以“xx%”表示的；以一系列不同转基因含量的标准DNA样品为PCR扩增模板，经过至少三次重复后，确定可以获得PCR扩增到的DNA样品的最低转基因含量为相对LOD值。绝对LOD值，指的是能够检测的最低转基因植物DNA的质量，一般是以“xx pg”或“xx拷贝”表示的。以纯的基因组DNA为标准样品，以不同浓度梯度DNA样品为PCR模板扩增，经过至少三次重复后，确

36、定可以获得PCR扩增到的DNA样品的最低DNA质量为绝对LOD值。已有转基因产品定性已有转基因产品定性PCRPCR检测方法检测方法 基因特异性：epsps、cry1Ab、Pat、bar、Gox、cry9C、NptII等 筛选特异性：CaMV35s启动子、NOS启动子和终止子、FMV35s等 构建特异性：主要的转基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系 转化体特异性：主要的转基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系上述方法LOD都达到0.1，且很多已经标准化成为ISO和我国国家标准！荧光定量 PCR（real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程

37、,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。定量定量PCRPCR检测方法检测方法荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。闭管反应(low contamination risk)无需PCR后操作(no gels,films etc)自动化高通量 单一反应管检测可以同时分析多个反应管定量定量PCRPCR检测方法特点检测方法特点 盖子盖子 PCR 管管 加热板加热板 样品样品透镜透镜荧光域值（荧光域值（threshold）以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循

38、环的荧光信号的标准偏差的10 倍.荧光信号荧光信号PCR 循环循环 (高浓度)高CT(低浓度)real-time PCR amplification plots(7 x 10-fold dilns.+NTC)终点终点（不能定量）（不能定量）阈值阈值低CTCt值值 循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；Ct值取决于阈值；Ct值与模板DNA的起始拷贝成反比，与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系；两个重要概念两个重要概念定量PCR检测方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR方法方法 u绝对定量法，绝对定量法，测样

39、品中的转指的是利用定量PCR反应及其构建的标准曲线，获得检基因植物基因组或外源目的基因的质量或拷贝数。转基因产品的定量PCR检测，主要可以分为两种方法：一种是绝对定量法，另一种是相对定量法。u相对定量法，相对定量法，是指利用定量PCR反应和构建的标准曲线，分析获得检测样品中转基因植物基因组或外源目的基因在样品基因组DNA中的百分含量，结果可以用转基因基因组DNA和样品基因组DNA的质量比或者转基因植物和样品的质量比表示。108106102104Tu绝对定量法外源基因标准曲线内标准基因标准曲线 获得的是样品中的植物基因组DNA或外源目的基因的绝对质量或拷贝数。u绝对定量法 基因植物（外源基因）基

40、因组质量或拷贝数100样品转基因含量（%）植物（内标准基因）基因组质量或拷贝数u相对定量法内标准基因外源基因CT(CT=参照基因的CT转基因的CT值）VS 转基因含量之间的标准曲线 定量定量PCRPCR方法的关键参数方法的关键参数 特异性特异性 Specificity Specificity 灵敏度灵敏度 Sensitivity Sensitivity 准确度准确度 Accuracy Accuracy 重复性重复性 Repeatability Repeatability 重演性重演性 Reproducibility Reproducibility特异性与灵敏度特异性与灵敏度只能在含有靶序列的转

41、基因产品中检测出阳性信号只能在含有靶序列的转基因产品中检测出阳性信号!需要测试不同植物品种需要测试不同植物品种需要测试不同的转基因植物需要测试不同的转基因植物足够低的检测灵敏度，满足转基因标识的要求足够低的检测灵敏度，满足转基因标识的要求 检测极限（LOD）定量极限（LOQ）定量定量PCRPCR方法可接受和应用基本要求方法可接受和应用基本要求ApplicabilityScope of the method,interferences with analytes etc.PracticabilityEquipment,timing,practical difficultiesSpecificit

42、yEvent-specificityDynamic RangeInclude the 1/10 and at least 5 times the target concentrationAccuracyWithin 25%of the reference valueR2 Coefficient 0.98PCR efficiency-3.1 slope 3.6RSDrBelow 25%over the whole dynamic rangeLOQLess than 1/10th of the value of the target concentration with an RSDr 25%LO

43、DLess than 1/20th of the target concentrationRobustnessDeviate not more than 30%RSDRBelow 35%at the target concentration;50%below 0.2%TruenessWithin 25 of the accepted reference value over the whole range荧光染料：SYBR Green I、Eva Green 引物特异性探针：Amplifluor(Intergen)Scorpions探针 通用模板探针（AUDP,UT）LUX（Light Upo

44、n Extension）探针序列特异性探针：荧光能量共振转移探针（FRET)双标探针（TaqMan、TaqMan MGB、LNA、Allglo）分子信标（Molecular Beacons，MB)实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR荧光探针类型和基本原理荧光探针类型和基本原理5353SGExcitationSGSGSGSGEmission原理 荧光染料法5353SGSGSGSGSGExcitationEmission优点：优点：（1）高度的通用性，几乎可以用于任何型号的定量高度的通用性，几乎可以用于任何型号的定量PCR仪和任何目标仪和任何目标DNA序列的扩增。序列的扩增。（2）无需另外设计荧光

45、探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低。）无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低。（3）PCR反应后可以进行融解曲线分析，分析反应的特异性和目标序列的突变等。反应后可以进行融解曲线分析，分析反应的特异性和目标序列的突变等。l 缺点：缺点：（1）不具备目标序列特异性，不能用于Multiplex PCR反应，容易受污染物，非特异性扩增产物和引物二聚体的干扰。（2）定量的准确性不高，重复性不强。（3）高浓度的染料会抑制PCR反应。Oligo 1:FluoresceinOligo 2:LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量转移探针（

46、FRET Probe）序列特异型探针 优点：优点：（1）为杂交型探针，自身不被降解，其荧光信号是可逆的，为杂交型探针，自身不被降解，其荧光信号是可逆的，PCR反应后可以进反应后可以进行融解曲线分析，突变分析，行融解曲线分析，突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别基因分型以及产物鉴别。（2）包含两条探针，具备很高的目标序列特异性，不受引物二聚体和非特异扩增）包含两条探针，具备很高的目标序列特异性，不受引物二聚体和非特异扩增的影响。的影响。l缺点：缺点：由于需要合成两条探针，探针的末端要封闭以避免延伸反应，所以合成的由于需要合成两条探针，探针的末端要封闭以避免延伸反应，所以合成的成本会比较高，也比较

47、麻烦成本会比较高，也比较麻烦。RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（TaqMan Probe）优点：优点：（1）具备目标序列特异性，良好的稳定性和灵敏度。）具备目标序列特异性，良好的稳定性和灵敏度。（2）有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测）有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测Multiplex PCR，降低成本也提高效率和准确性。降低成本也提高效率和准确性。（3）探针自身对）探针自身对PCR反应的影响较小，定量的准确性高。反应的影响较小，定量的准确性高。TaqMan 是应用最广泛，最成熟的荧光定量技术

48、，广泛的应用于人类传染病诊断、动物疾病检测以及转基因作物定量检测等。l 缺点：缺点：（1）探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高。(2)探针较长使得两端基团距离较远，导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也 会 产生不同波长的荧光，本底信号偏高，信噪比不高。（3）其为水解型探针，反应中探针会水解，荧光信号不可逆，不能用于融解曲线分析。TaqMan MGB 针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针,即TaqMan MGB，其工作原理与TaqMan 探针相同。TaqMan MGB优点优点（1）3端采用了非荧光性的淬灭基因。（2

49、）MGB探针的3端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide,DPI3)，可以大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm 值，提高探针的特异性。（3）探针可以设计得更短，荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。（4）MGB探针对于等位基因的区分比较理想，可以检测单碱基突变。现在它也是转基因作物定量检测中的一种常用的定量技术。RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标（Molecular Beacon Probe）序列特异型探针 l缺点缺点:(1)杂交时探针不能完全与模

50、板结合，因此稳定性较差。(2)探针合成时标记较复杂。分子信标是转基因定量检测的常用的技术，它还可以用于突变检测，SNP检测，在其基础上发展的技术有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion 等。目前常用的序列特异性探针比较目前常用的序列特异性探针比较完成验证方法44个，正在进行中31个！535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR2.3.1 Amplifluor引物特异性探针优点：优点：1 它是引物特异性探针，不需要引物以外的探针，节约成本，反应体系优化更加方便。2 它是积累性荧光，信号不可逆，可用于融解曲线分析。3