色谱法硅醇基效应的消除流动相方面的改进课件.ppt

1、第四节第四节 含量测定含量测定 生物碱类药物由于品种多，结构多变，性质各异，可利用的含量测定方法也较多。原料药物的含量测定，主要是利用整个分子的碱性，根据其碱性强弱以及存在形式的溶解行为，多采用非水溶液滴定法；制剂的含量测定方法主要有紫外分光光度法(包括酸性染料比色法)、色谱法、提取酸碱滴定法、荧光分光光度法等。ChP2015中收载的常见生物碱及其制剂的含量测定方法见表12-2。含量测定含量测定()非水溶液滴定法非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行的酸碱滴定测定法。主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐以及有机酸碱金属盐类药物的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。一、非水溶液滴定法(弱碱性

2、)l溶剂种类溶剂种类 l（1）酸性溶剂：有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强）酸性溶剂：有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱度，最常用的酸性溶剂是冰醋酸。其相对碱度，最常用的酸性溶剂是冰醋酸。l（2）碱性溶剂：有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强）碱性溶剂：有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸度，最常用的碱性溶剂是二甲基甲酰胺。其相对酸度，最常用的碱性溶剂是二甲基甲酰胺。l（3）两性溶剂：兼有酸碱两种性能，最常用的是甲醇。）两性溶剂：兼有酸碱两种性能，最常用的是甲醇。l（4）惰性溶剂：溶剂没有酸碱性，如甲苯、三氯甲烷、）惰性溶剂：溶剂没有酸碱性，如甲苯、三氯甲烷、丙酮。丙酮。一、非水溶液酸碱滴

3、定法一、非水溶液酸碱滴定法(一)原理与方法原理原理 生物碱类药物一般具有弱碱性弱碱性，在水溶液中用酸滴定液进行直接滴定时没有明显没有明显的滴定突跃的滴定突跃，难于掌握终点，不能顺利的滴定。而在酸性非水介质(冰醋酸、醋酐)中，生物碱的碱性显著增强，滴定突跃增大，滴定可顺利进行。生物碱类药物绝大多数都以盐的形式供临床使用，即供分析用的多为生物碱盐类。其盐的滴定，实际上是一个置换反应，即用强酸滴定液置换出与生物碱结合的较弱的酸。式中BH+A-表示生物碱盐类，HA表示被置换出的弱酸。由于被置换出的HA酸性强弱不同，对滴定反应的影响也不同，若置换出的HA酸性较强，则反应不能定量的完成。因此在实际滴定中，

4、必需根据具体情况，采取相应的测定条件，设法将HA除去或减少其产生，使反应顺利完成。方法方法 除另有规定外，精密称取供试品适量约消耗高氯酸滴定液(0.1mol/L)8 ml，加冰醋酸1030ml使溶解。加各品种项下规定的指示液12滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定。终点颜色以电位滴定时的突跃点为准，并将滴定的结果用空自试验校正。(二二)测定条件的选择测定条件的选择 适用的范围及溶剂的选择适用的范围及溶剂的选择 主要应用于主要应用于pKb 88的有机碱性药物及其盐的含量的有机碱性药物及其盐的含量测定。条件选用适当的测定。条件选用适当的p pK Kb b为为813813的弱碱均可采用的弱碱均

5、可采用。对于碱性较弱的药物对于碱性较弱的药物pKb为810时，宜选用冰醋酸，pKb为为1012时，宜选用冰醋酸与醋酐混合时，宜选用冰醋酸与醋酐混合溶剂，溶剂，pKb大于大于12时，就以醋酐为溶剂。时，就以醋酐为溶剂。酸根的影响酸根的影响 在生物碱盐的滴定中，与之成盐的酸在冰醋酸中的酸性强弱对滴定能否顺利进行有关。各种酸在冰醋酸中的酸性强弱顺序为:高氯酸氢溴酸硫酸盐酸硝酸磷酸有机酸 由此可见，如被置换出的是氢卤酸，其在冰醋酸中的酸性较强，对滴定终点有影响，需要进行处理。一般处理方法为在滴定反应开始前，预先在冰醋酸中加入醋酸汞的冰醋酸溶液，使氢卤酸生成在冰醋酸中难解离的卤化汞而排除干扰，然后再用高

6、氯酸滴定液滴定。当醋酸汞的量加入不足时，滴定终点仍不准确，会使测定结果偏低，一般加入量以其理论量的13倍为宜。然而醋酸汞是剧毒的化学物质，且严重污染环境，近年来生物碱类药物氢卤酸盐的非水溶液滴定法逐渐改用醋酐代替冰醋酸作溶剂，并以电位法指示终点，以避免使用醋酸汞。终点指示方法终点指示方法 一般指示终点的方法有电位法和指示剂法。结晶紫由碱性区域到酸性区域的颜色变化为紫、蓝紫、蓝绿、绿、黄。滴定液的稳定性滴定液的稳定性 本法的溶剂冰醋酸具有挥发性，且膨胀系数较大，因此温度和贮存条件等都影响滴定液的浓度。需校正 注意事项注意事项 水分高浓度的高氯酸与醋酐混合时容易引起爆炸，配制时应先将高氯酸用冰醋酸

7、稀释后再加入醋酐。(三三)应用实例应用实例二、紫外二、紫外-可见分光光度法可见分光光度法基本原理基本原理有机相(BH+In-)水相(BH+In-)+HIn H+In-+B H+BH+UV(二二)酸性染料比色法酸性染料比色法 也可分离出有机相，然后用碱化试剂碱化有机相，将离子对中的酸性染料释放出来，用水提取In-，测定水中染料的吸光度，间接计算出碱性药物的含量。本法具有专属性强、准确度好、灵敏度高、试样用量少等优点，适用于小剂量生物碱类药物及其制剂以及生物体内生物碱类药物的定量分析。中国药典对硫酸阿托品、氢溴酸山莨菪碱的片剂和注射剂的含量测定均采用此法。测定条件与影响因素测定条件与影响因素u 水

8、性最佳pH值：使得使得BHBH+和和InIn-最多最多u 酸性染料及其浓度：定量结合；对离子对的溶解定量结合；对离子对的溶解 性好；有较高的吸收度；足够量即可性好；有较高的吸收度；足够量即可u 有机溶剂的选择：提取效率高，氯仿最理想提取效率高，氯仿最理想u 水分的影响：影响结果，脱水剂或滤纸除去水分影响结果，脱水剂或滤纸除去水分u 酸性染料中的有色杂质：有机溶剂萃取除去有机溶剂萃取除去应用示例硫酸阿托品片的含量测定精密量取对照品溶液和供试品溶液各精密量取对照品溶液和供试品溶液各2ml2ml，分别置预先精密，分别置预先精密加入加入三氯甲烷三氯甲烷10ml10ml的分液漏斗中，各加的分液漏斗中，各

9、加溴甲酚绿溴甲酚绿溶液溶液4ml4ml，振摇提取后，静置使分层；分取三氯甲烷液，照紫外振摇提取后，静置使分层；分取三氯甲烷液，照紫外-可见可见分光光度法，在分光光度法，在420nm420nm波长处分别测定吸光度，计算，即得。波长处分别测定吸光度，计算，即得。测定法测定法 精密量取对照品溶液和供试品溶液各2ml，分别置预先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚绿2.0ml，振摇提取两分钟后，静止分层，分取澄清的三氯甲烷液，在420nm波长处分别测定吸光度，计算，并将结果与1.027相乘，即得本品（C17H23NO3）2H2SO4H2O相当标示量的百分含量。百分标示量%100027.15

10、0标示量mWCAASSx式中Ax、AS分别为供试品和对照品溶液的吸光度；CS为对照品溶液的浓度mg/ml；m为样品片粉质量；W为平均片重。1.027为（C17H23NO3）2H2SO4H2O与（C17H23NO3）2H2SO4H2O的质量换算系数。Fig.12-2 The UV-spectrum of atropine sulfate with BTB ions1.离子对 2.染料空白（对照品平行测定，空白吸收可被扣除）3.阿托品（水溶液在420nm附近无吸收）适用范围广适用范围广 分离模式多样分离模式多样 检测手段多样灵敏检测手段多样灵敏 选择和专属性强选择和专属性强 分离速度快分离速度快重

11、复性好重复性好 HPLC优点优点各国药典中采用各国药典中采用HPLC法对莨菪类生物碱的含量和有法对莨菪类生物碱的含量和有关物质进行直接分析测定的比例不断增加。关物质进行直接分析测定的比例不断增加。三、色谱法三、色谱法硅醇基效应的消除硅醇基效应的消除流动相方面的改进流动相方面的改进在流动相中加入含氮碱性竞争试剂(或称扫尾剂、改性剂)，可抑制或掩蔽固定相表面的游离硅醇基的活性，使生物碱易出峰，且峰形好，最常用的硅醇基抑制剂有二乙胺、三乙胺等。在适当的pH下使生物碱解离，再在流动相中加入电荷相反的离子对试剂，生成离子对化合物而掩蔽生物碱的碱性基团，这样就避免与游离的硅醇基作用，使待测组分在非极性固定

12、相中的分配与溶解度增大，从而改善其色谱保留与分离行为。在流动相中加入季铵盐等掩蔽试剂，如在甲醇一水的流动相中加入0.01mol/L的溴化四甲基胺，能在较短的保留时间内获得良好的分离，色谱峰重现性好，也不拖尾，而且甲醇水比例的改变和pH的变化都不影响峰形的对称性，季铵盐与固定相表面的硅羟基生成复合物而掩蔽了固定相表面的游离硅醇基。在流动相中加入电解质缓冲盐，通过改变流动相的离子强度，稳定pH及促进离子对相互作用，起到改善峰形和分离效果的作用。色谱保留常常色谱保留常常较弱，从而影较弱，从而影响到它们的含响到它们的含量或有关物质量或有关物质HPLCHPLC测定的专测定的专属性和准确度。属性和准确度。

13、采用离子对采用离子对高效液相色高效液相色谱法，可以谱法，可以改善它们的改善它们的色谱保留行色谱保留行为，并实现为，并实现准确测定。准确测定。在反相液相色谱条件下呈离子状态的药物，如有机碱类、在反相液相色谱条件下呈离子状态的药物，如有机碱类、有机酸类等有机酸类等调整流动相调整流动相的的pHpH，抑制，抑制它们的解离，它们的解离，以改变色谱以改变色谱保留行为。保留行为。但并不都能但并不都能获得满意的获得满意的结果。结果。固定相方面的改进固定相方面的改进选择碳链较短的键合相硅胶填料，例如C8比C18好，原因可能是由于硅烷的碳链较短则覆盖度更大，只有较少量的游离硅醇基;采用端基封尾技术，即在C18键合

14、反应结束后，用短链氯硅烷(如三甲基氯硅烷)键合残留的活性硅羟基。生物碱的色谱分离模式多样，除了常采用的PR-HPLC，目前文献报道也可见到采用正相色谱法、吸附色谱法或离子交换色谱法等各种方法。生物碱类成分进行高效液相色谱法测定时，使用较多的是紫外检测器，其他如电化学检测器、化学发光检测器等也适用于生物碱类成分的测定，如果化合物能产生荧光，还可以使用荧光检测器。(二)气相色谱法 气相色谱法可用于某些具有挥发性、遇热不分解的生物碱及其盐类的分析，游离生物碱可直接进样，生物碱盐一般会在高温加热下，快速解离成游离生物碱后再进行色谱柱分析，但生物碱盐类在高温加热解离后所生成的酸容易损伤色谱柱和检测器，所

15、以一般在测定前先用碱水碱化，再用有机溶剂提取分离，制得游离生物碱溶液后再进样分析。四、提取酸碱滴定法四、提取酸碱滴定法 有些生物碱类药物由于其样品中其他组分对测定有干扰，测定前需经过碱化、有机溶剂提取后再进行酸碱滴定，称为提取酸碱滴定法。本法适用于碱性较强(pKb69)的生物碱盐类药物，这类成分水相即可达到明显的滴定突跃。经碱性试剂碱化、有机溶剂提取后，可采用酸碱滴定的方法测定含量。五、荧光分析法五、荧光分析法 在紫外-可见光的激发下，有些生物碱或其化学反应产物能产生荧光，利用这一性质可用荧光分析法测定其含量。荧光分析法主要适用于制剂和体内药物分析，其具有灵敏度高、选择性好等优点但同时也存在干扰因素多、线性范围较窄等问题。如中国药典利舍平片的含量测定即采用本法。