第四章-DNA重组和基因转移课件.ppt
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- 关 键 词:
- 第四 DNA 重组 基因 转移 课件
- 资源描述:
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1、第一节第一节 目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接一一 粘末端粘末端DNA片段片段的连接的连接(一)具有相同粘末端的(一)具有相同粘末端的DNA分子分子 之间的连接之间的连接 使用碱性磷酸酶处理载体使用碱性磷酸酶处理载体DNA,去掉其去掉其5末端的磷酸基,以防质末端的磷酸基,以防质粒粒DNA的自身环化的自身环化。(二)(二)具有不同粘性末端的具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接分子之间的连接 用两种不同的限制性内切酶对载体和外源用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切进行切割后,在它们两端会产生非互补的突出端,经割后,在它们两端会产生非互补的突出端,经DNA连接酶连接酶连接连接后
2、即产生定向重组体。后即产生定向重组体。HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI对载体酶切HindIIIEcoRI对基因酶切对基因酶切质粒载体的定向重组质粒载体的定向重组1 直接用直接用T T4 4连接酶连接连接酶连接2 同聚物加尾法同聚物加尾法3 衔接物连接法衔接物连接法衔接物衔接物是指用化学方法合成的一段由是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成,具个核苷酸组成,具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。所谓载体与所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配,指载体与待克隆的片段酶切位点不匹配,指载体与待克隆的DNA片段
3、上的酶切位点不相同,因而用一种或两种酶切制片段上的酶切位点不相同,因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。造不出可互补的粘性末端。1 按照平末端连接方法加上接头按照平末端连接方法加上接头2 将凹端变为平端将凹端变为平端(1 1)使用)使用KlenowKlenow酶在酶在4 4种种dNTPdNTP存在下,将存在下,将33凹端完全补平。凹端完全补平。(2 2)用)用S1核酸酶去除核酸酶去除3突出末端产生平端突出末端产生平端DNA分子分子 3 3 使用大肠杆菌使用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I Klenow片段部分补平片段部分补平3凹端转凹端转 变成粘端。变成粘端。载体经载体经XhoI酶切形成:
4、酶切形成:外源基因用外源基因用San3A酶切形成:酶切形成:用用Klenow酶部分补平二者的酶部分补平二者的3 凹端,形成:凹端,形成:TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA这样,就可以实现有效重组。这样,就可以实现有效重组。TCGAAGCT3355GATCCTAG3355通过依次加入、连接合成通过依次加入、连接合成的的DNA接头进行接头进行cDNA克隆克隆外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况:外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况:(2)(3)(1)转化转化E.coli(一)根据载体表型特征选择重组体分子(一)根据载体表型特征选择重组体分子1 抗药性标记插入失活筛
5、选法抗药性标记插入失活筛选法例:例:pBR322pBR322 如果外源基因插入到如果外源基因插入到tetr基因内部,基因内部,tetr抗性消失,表型抗性消失,表型为不抗四环素(为不抗四环素(tets)、)、而仍抗氨苄青霉素(而仍抗氨苄青霉素(ampr),),这样的这样的转化细胞在含有转化细胞在含有 amp的培养基仍可生长,但在含有四环素的的培养基仍可生长,但在含有四环素的培养基上不能再生长;反之,如果培养基上不能再生长;反之,如果ampr基因由于外源基因插基因由于外源基因插入其内部而失活,带有重组入其内部而失活,带有重组DNA分子的转化细胞在含有分子的转化细胞在含有tet的的培养基平板上生长,
6、在含有培养基平板上生长,在含有 amp的培养基不能生长。的培养基不能生长。例例:pUC质粒质粒 在在LacZ的大肠杆菌中,在平板培养中,菌落是白色的。的大肠杆菌中,在平板培养中,菌落是白色的。若在该细胞中引入若在该细胞中引入pUC质粒,其上有质粒,其上有LacZ,质粒和大肠杆质粒和大肠杆菌菌DNA可实现可实现互补,菌落呈蓝色。互补,菌落呈蓝色。如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因,则因,则LacZ基因受到破坏,便不能再和缺陷型受体菌中生基因受到破坏,便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的成有活性的-半乳糖苷酶,因此,菌落呈白色。半乳糖
7、苷酶,因此,菌落呈白色。(二)(二)根据插入序列的表型特征选择重组体根据插入序列的表型特征选择重组体 进入受体细胞的重组进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果在宿主分子中的外源基因如果在宿主细胞中能实现功能表达,产生出有功能活性的基因产物,那细胞中能实现功能表达,产生出有功能活性的基因产物,那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。2 互补互补凝胶电泳检测法凝胶电泳检测法例:原位杂交筛选重组例:原位杂交筛选重组体菌落体菌落(或噬菌斑或噬菌斑)免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基免疫化学检测法是利用抗体与
8、抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达,在这个克隆因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达,在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白,即可用特异性抗体来检测。中就存在着这个基因的特定蛋白,即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种。标记抗体测定法的步骤:标记抗体测定法的步骤:转化菌落转化菌落影印平板影印平板置于含氯仿饱合气体的容器置于含氯仿饱合气体的容器细菌裂解,抗原释放细菌裂解,抗原释放覆盖吸附有未经标记的抗体的覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜膜形成抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物将将NC膜与膜
9、与I125标记的抗体温育标记的抗体温育 放射自显影放射自显影与母板对照,挑取所需的重组克隆与母板对照,挑取所需的重组克隆 用免疫化学法检测克隆在表达载体用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因上的基因第三节第三节 基因转移方法基因转移方法一一 重组重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌(一)(一)转化转化 将外源将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。为了有效地使细菌吸收外源的为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子,我们通常要对它们分子,我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理,处理后的细胞吸收外源进行一些物理或化学的处理,处理后的细胞吸收外
10、源DNA的的能力大大提高,被称为能力大大提高,被称为感受态细胞感受态细胞。对于大肠杆菌细胞,一般采用对于大肠杆菌细胞,一般采用50mmol/L的的CaCl2溶液来制备溶液来制备感受态细胞。感受态细胞。(1)吸附阶段:完整的双链)吸附阶段:完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面分子吸附于感受态细胞表面(2)转入阶段:双链)转入阶段:双链DNA分子解链,以单链形式进入细胞,分子解链,以单链形式进入细胞,而另一链则被降解而另一链则被降解(3)自身稳定阶段:外源质粒在细胞内又复制成双链环型)自身稳定阶段:外源质粒在细胞内又复制成双链环型 DNA(4)表达阶段:即目的基因随质粒的复制子一起复制,并被表
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